长春花MT基因克隆、原核表达及其功能分析

论文摘要

金属硫蛋白是一类分子量较小、富含Cys的金属结合蛋白，广泛分布于生物界。近年来研究表明，金属硫蛋白参与体内微量元素的储存、转运和代谢，拮抗电离辐射，清除自由基以及对重金属的解毒作用。植物MT的发现相对较晚，研究表明，植物金属硫蛋白可以通过其大量的Cys残基螯合重金属并清除活性氧，使植物免受氧化损伤，参与了植物的发育、胚胎发生、抵抗逆境胁迫等多种生理过程，是一种重要的功能基因。但其蛋白功能尚未完全清楚。为了充分研究植物金属硫蛋白的功能，更多有关于植物的MTs基因克隆和功能分析的研究将对进一步研究和开发植物金属硫蛋白具有重要的科学价值。本论文首次从长春花cDNA文库中克隆了长春花金属硫蛋白（CrMT）全长基因序列，采用基因重组技术，将长春花CrMT基因重组入原核表达载体pGEX-6P-1中，该载体含有一个谷胱甘肽-S-转移酶（GST）基因，便于融合蛋白表达后的纯化。将重组质粒转入E coli BL21中进行体外表达，SDS-PAGE分析表明，经IPTG诱导后成功地表达了目的融合蛋白GST-CrMT。通过研究了温度、诱导时间以及诱导剂IPTG终浓度等不同条件对GST-CrMT融合蛋白表达量的影响，优化了原核表达条件，获得了较高浓度的GST-CrMT融合蛋白，为制备抗体进行Western杂交打下基础。利用Anti-GST抗体进行Western-blotting检测，鉴定了表达蛋白发生特异免疫反应。通过对MT的重金属离子耐受性进行了研究，既能抑制细菌的生长，又不至于使细菌死亡的适合金属离子浓度分别为CdCl2 1.6 mM and ZnCl2 1.0 mM。转化MT的大肠杆菌BL21与对照相比，对重金属耐受性都得到了增加。本论文通过使用SignalP 3.0 Server对来自长春花的CrMT进行了信号肽分析，将CrMT基因与绿色荧光蛋白GFP基因融合，构建到酵母表达载体pYES2，通过电转化法将pYES2-CrMT-GFP质粒转入酵母（Saccharomyce，scerevisiae）INUScl中，利用激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Biological Microscope，Nikon）观察，从而对CrMT基因编码的蛋白在酵母细胞中进行定位，结果证明CrMT基因编码的蛋白存在于酵母的细胞质中。本研究结果为进一步了解植物金属硫蛋白的表达调控机理、结构和功能具有重要的科学参考价值，对开发植物金属硫蛋白产品提供重要的科学研究基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 金属硫蛋白简介
• 1.1.1 金属硫蛋白定义、命名、分类
• 1.1.2 金属硫蛋白的结构
• 1.1.3 金属硫蛋白（MT）的基本特性
• 1.1.4 金属硫蛋白（MT）的主要功能
• 1.2 植物金属硫蛋白
• 1.2.1 植物MT分类与表达
• 1.2.2 植物MT的功能
• 1.3 长春花金属硫蛋白（Catharanthus roseus metallothionein，CrMT）的概述
• 1.3.1 同源性比对分析
• 1.3.2 进化树分析
• 1.3.3 氨基酸组成分析
• 1.3.4 蛋白三维结构预测
• 1.3.5 疏水性分析
• 1.4 研究目的与意义
• 2 长春花CrMT基因的原核表达载体的构建
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要试剂与酶类
• 2.2 方法
• 2.2.1 目的蛋白CrMT-1及引物设计
• 2.2.2 PCR扩增目的蛋白CrMT-1
• 2.2.3 PCR产物纯化
• 2.2.4 pGEX-6P-1质粒抽提
• 2.2.5 pGEX-6P-1-CrMT重组质粒的构建
• 2.3 结果
• 2.3.1 扩增目的基因CrMT-1的鉴定
• 2.3.2 PCR鉴定CrMT-1阳性转化子
• 2.3.3 重组质粒pGEX-6P-1-CrMT的鉴定
• 2.3.4 重组质粒pGEX-6p-1-CrMT测定结果
• 2.4 本章小结
• 3 长春花MT在大肠杆菌中的融合表达及其耐受重金属离子的特性
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株及质粒
• 3.1.2 实验试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 重组菌的表达筛选
• 3.2.2 蛋白质的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3.2.3 诱导表达条件的优化
• 3.2.4 GST-CrMT融合蛋白的大量表达、纯化及鉴定
• 3.2.5 Western blotting分析
• 3.2.6 检测表达融合蛋白的大肠杆菌对重金属离子的耐受性
• 3.3 实验结果与分析
• 3.3.1 重组菌的表达筛选
• 3.3.2 诱导表达条件的优化
• 3.3.3 GST-CrMT融合蛋白的纯化
• 3.3.4 Western blotting分析
• 3.3.5 GST-CrMT融合蛋白在大肠杆菌中对重金属离子的耐受性
• 3.4 本章小结
• 4 CrMT基因编码的蛋白在酵母细胞中的定位
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株及载体
• 4.1.2 酶和试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 质粒pYES2-CrMT-GFP的构建
• 4.2.2 酵母细胞的培养
• 4.2.3 活细胞显微镜观察
• 4.3 实验结果与分析
• 4.3.1 质粒pYES2-GFP和pYES2-CrMT-GFP的酶切鉴定
• 4.3.2 CrMT基因编码的蛋白在酵母细胞中的定位
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢