不同源性禽流感病毒株的分离鉴定及其主要基因信息的研究

论文摘要

经过病毒分离从鸡、鸭、鹅、鸽子和猪等咽喉、泄殖腔棉拭子和体内样品中分离到17株鸡源、鹅源、鸭源、鸽源和猪源禽流感病毒，经负染后用电子显微镜观察，可见球形，外被囊膜的病毒颗粒。经HI和NI试验和荧光RT-PCR技术鉴定为H5亚型或H9亚型禽流感病毒。对各毒株EID50、IVPI、ICPI和致病性试验结果表明，分离到4株鸡源、8株鹅源、1株鸭源、1株鸽源和1株猪源H5N1亚型高致病性禽流感病毒株；1株鸡源H5N2亚型和1株鸡源H9N2亚型低致病性禽流感病毒株。经过理化特性试验可知：AIV分离株均为热不稳定性，56℃30min、60℃10min和65-70℃3min即可被灭活。禽流感病毒分离株对乙醚、氯仿和酸均敏感。根据GeneBank中已知的基因序列，设计合成6对用于扩增H5N1、H5N2、H9N2亚型血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因的特异性引物。提取病毒基因组总RNA，运用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分别扩增6株鸡源、8株鹅源、1株鸭源、1株鸽源和1株猪源病毒分离株的的两个基因片段，并分别连接到载体pMD18-T上，转化到感受态细胞，提取质粒，进行PCR和酶切鉴定及其序列测定。结果表明：分别扩增和克隆出上述各毒株的HA和NA两基因片段，该15株H5N1亚型AI毒株HA基因阅读框基因全长1707bp，编码568个氨基酸。HA1、HA2的裂解位点附近有连续6个碱性氨基酸（RRRKKR）的插入，为高致病性AIV的分子特征。在HA肽链上有6个或7个潜在的糖基化位点。受体结合位点相对应的氨基酸分别为YWIHELY，左侧壁氨基酸为SGVSS，右侧壁氨基酸为NGQSG。决定宿主特异性的受体结合位点226位和228位氨基酸具有与禽类细胞受体结合特异性。NA基因阅读框基因全长为1350bp（G7 1410bp），编码450（G7 469）个氨基酸。有3个或4个（G7）糖基化位点。H5N1亚型毒株（除G7外）在NA基因第48位氨基酸后缺失了20个氨基酸，具有当地流行株的特征。H5N2和H9N2 AIV毒株血凝素（HA）阅读框基因全长分别为1695 bp、1683bp，分别编码564个氨基酸和560个氨基酸。HA1、HA2的裂解位点附近无连续碱性氨基酸的插入，为非高致病性AIV的特征。H5N2亚型AIV株的NA基因全长1401bp，编码467个氨基酸；H9N2亚型AIV株NA基因全长1410bp，编码470个氨基酸，其受体结合位点的氨基酸分别为YWTNVLY，左侧壁氨基酸为NGQQG，右侧壁为GTSKA。利用分析软件对分离株之间的HA、NA基因，对分离株与参考毒株的之间的HA、NA基因进行同源性比较分析。分离株之间同源性比较结果表明：分离株之间的HA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.4％～99.6％和95.2％～99.5％；NA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.9％～100％和95.3％～100％。分离株与参考毒株株之间的HA基因和NA基因的同源性比较结果表明：分离株与参考株之间HA基因的核苷酸、氨基酸同源性分别为94.2％～99.9％和94.2％～99.6％；分离株与参考株之间的NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为86.0％～100％和86.6％～100％。本地区分离到的17个毒株遗传演化关系发现：同一亚型毒株同源性比较高，没有明显宿主差异。分离株的基因来源不同，因此导致毒株基因多样性。根据GeneBank中已知的AIV8个基因序列设计合成11对特异性引物，从尿囊液中提取病毒基因组总RNA，运用RT-PCR技术分别扩增2株鹅源和1株鸽源分离株的8个基因片段的cDNA，克隆、序列测定。结果表明，所克隆到的8个片段即HA、NA、NP、M、PB1、PB2、PA和NS，各基因均包含相应的病毒基因完整开放阅读框架。8个基因片段的长度分别为1730bp、1371 bp（1410bp）、1542 bp、2322 bp、2330 bp、2233 bp、1020 bp和884 bp核苷酸，并分别编码568、449（G7为469）、499、757、759、716、351和230个氨基酸。通过3株H5N1亚型禽流感病毒株全基因遗传演化分析表明：本区域内毒株分两组，G7组：其NA基因、NS基因均无氨基酸缺失，与A／GS／HK／ww28／00各基因同源性为98.1％～99.6％，其中与HA、NA、NP和PB14个基因的核苷酸均高于99.1％、因此G7的4个基因可能由A／GS／HK／ww28／00提供，两毒株均来源于A／GS／GD／1／96，一同处于等位基因内；G8、P组：在NA基因第48位氨基酸后缺失了20个氨基酸，在NS基因第79-84位缺失5个氨基酸；与其它参考毒株处于同一等位基因内。用1株鹅源H5N1亚型AIV对非免疫鸡进行滴鼻点眼、肌肉注射、静脉注射三种途径攻毒，攻毒后18-196h可以从咽喉、泄殖腔拭子分离到病毒。攻毒后24-240h可以从心、肝、脾脏、肺脏、肾脏、脑和肌肉等脏器利用荧光RT-PCR及免疫荧光检测到病原，结果表明该毒株对鸡有较强的致病性，病毒抗原在各部位定植时间不同。

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前言

第一部分文献综述

综述一禽流感病原学研究进展

1 禽流感的流行状况

1.1 禽流感的世界流行状况

1.2 禽流感的国内流行状况

1.3 禽流感流行病学特点

2 禽流感的危害

2.1 禽流感对养禽业的危害

2.2 禽流感对畜牧业的危害

2.3 禽流感病毒对野生哺乳动物的危害

2.4 禽流感病毒对人的危害

3 禽流感病原

3.1 禽流感概况

3.2 禽流感病毒结构

3.3 禽流感病毒的化学组成

3.4 禽流感病毒的抵抗力

3.5 禽流感病毒基因组、编码的蛋白质及其功能

4 禽流感病毒的复制

5 禽流感病毒的致病力

6 禽流感病毒的抗原性变异

7 禽流感病毒的传播

8 禽流感的主要临床症状和主要病理组织学变化

8.1 禽流感的主要临床症状

8.2 禽流感主要病理解剖学变化

8.3 禽流感病理组织学变化

9 水禽在禽流感中的作用

10 候鸟在禽流感中的作用

11 禽流感诊断进展

12 禽流感病毒疫苗的研制

12.1 灭活疫苗

12.2 基因工程疫苗

综述二禽流感病毒基因组、编码蛋白、功能及分子致病性研究进展

1 禽流感病毒基因组

2 病毒的主要蛋白及功能

2.1 血凝素

2.2 神经氨酸酶

2.3 核蛋白

2.4 基质蛋白

2.5 非结构蛋白

2.6 聚合酶

3 禽流感病毒的抗原性变异及其进化

3.1 抗原漂移

3.2 抗原转变

3.3 缺损干扰颗粒和RNA重组

3.4 禽流感病毒的进化

4 禽流感病毒致病性的分子基础

4.1 HA与细胞表面特异性病毒受体的结合是导致病毒感染的先决条件

4.2 宿主细胞蛋白酶种类及活性对HA裂解性具有重要影响

4.3 禽流感病毒毒力高低与HA裂解位点氨基酸的性质及组成序列有关

4.4 裂解位点插入细胞的多肽序列会使病毒对裂解的敏感性增加

4.5 裂解位点附近的糖链对HA的裂解有影响

4.6 NA对禽流感病毒的致病性有一定影响

4.7 NS基因对毒力的影响

4.8 NP对禽流感病毒复制及感染能力的影响

综述三禽流感及其公共卫生意义

1 人禽流感流行病学现状

2 决定宿主特异性的因素

2.1 HA的细胞受体结合位点

2.2 HA上的受体结合位点与宿主细胞的HA受体的关系

2.3 NA的氨基酸组成及其糖基化对流感病毒宿主特异性的影响

2.4 NP对禽流感病毒的宿主特异性的影响

2.5 其他基因对流感病毒宿主特异性的影响

3 禽流感病毒跨种属感染人的机制

4 禽流感病毒对人呼吸道的感染机制

4.1 禽流感病毒基因高变异率是决定其对人致病的主要因素

4.2 禽流感病毒通过进化具备侵入人体并在人体内有效复制的能力

5 从人流感的起源看禽流感与人流感的关系

6 禽流感与公共卫生意义

第二部分研究内容

实验一不同原性禽流感病毒株的分离鉴定与生物学特性研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 病毒的分离结果

2.2 血清学鉴定结果

2.3 血凝素亚型鉴定结果

2.4 荧光RT-PCR检测结果

2.5 电镜观察结果

2.6 血凝素热稳定性实验结果

2.7 化学特性实验结果

50的测定结果'>2.8 EID₅₀的测定结果

2.9 鸡静脉指数（IVPI）实验结果

2.10 鸡脑内致病指数（ICPI）实验结果

2.11 致病性实验结果

3 讨论

4 小结

实验二不同原性禽流感病毒株血凝素基因和神经氨酸酶基因的扩增、克隆与序列分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 RT-PCR结果

2.2 重组质粒的PCR鉴定结果

2.3 重组质粒的限制性内切鉴定结果

2.4 17株不同亚型禽流感病毒毒株HA基因、NA基因的核苷酸和氨基酸序列测定与特征性分析

2.5 AI病毒分离株HA基因和NA基因的比较分析及其遗传演化分析

3 讨论

4 小结

实验三两株鹅源和1株鸽源H5N1亚型AIV分离株全基因克隆及序列分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 PCR扩增结果

2.2 PCR产物纯化、克隆及PCR鉴定结果

2.3 测序结果与基因序列同源性分析

2.4 8个基因的遗传进化分析结果

3 讨论

4 小结

实验四试验鸡感染鹅源H5N1亚型禽流感病毒后排毒规律以及鸡体内病毒抗原定位动态的研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 试验组的临床症状

50和LD₅₀的测定结果'>2.2 ELD₅₀和LD₅₀的测定结果

2.3 病毒分离结果

2.4 病毒鉴定结果

2.5 荧光RT-PCR检测结果

2.6 免疫荧光检测结果

3 讨论

4 小结

结论

参考文献

致谢

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