欧美杨R270 GA 20-氧化酶基因及GASA基因的克隆和功能分析

论文摘要

在世界范围内大多数林木育种的主要目的是提高植株高度和生长速率,目前许多研究通过增加植物内赤霉素含量或是加强赤霉素信号来改良树种。在植物整个生命周期中赤霉素调控很多发育过程,关于赤霉素合成酶研究最多的是GA20-氧化酶,它在赤霉素合成途径中起到限速作用,对决定很多植物中赤霉素含量方面起到重要作用。虽然已经阐明了赤霉素早期的信号转导途径,但是关于赤霉素下游信号对生长发育的响应机制大多没有研究清楚,拟南芥中GASA （GA-Stimulated in Arabidopsis）基因家族很多成员受到赤霉素调节,对其研究表明可能调控细胞分裂和伸长。本研究对GA20-氧化酶基因及GASA基因的功能分析,为培育黑杨的速生品系及阐明GASA蛋白在赤霉素信号转导途径中的功能提供线索。利用PCR方法分别从欧美杨R270（Populus deltoides X Populus nigra）与野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆得到GA20-氧化酶基因,将其转入拟南芥获得转基因植株,进行黑杨GA20-氧化酶基因的功能分析。结果表明超量表达PdGA20ox基因的拟南芥与超量表达ATGA20oxl基因的拟南芥相比,能够提早萌发和抽薹,促进下胚轴、根、叶片的伸长及茎的增高和加粗。本实验是在实验室前期基因芯片分析结果的基础上,在欧美杨R270中克隆得到在赤霉素信号转导途径起作用的PdGASA1、PdGASA2和PdGASA4基因。在野生型拟南芥中超表达这3个基因,结果表明转基因株系在萌发速率、根长、叶面积和株高上都有所提高。通过对黑杨组培苗进行植物激素处理,检测了该处理条件下基因表达量的变化,结果表明PdGASA基因与赤霉素调控相关。将PdGA20ox、ATGA20ox1与PdGASA基因分别转化黑杨,经筛选获得了2个转基因株系,采用PCR方法证实了外源基因已整合到杨树基因组中,成功建立了欧美杨R270遗传转化体系。为下一阶段研究黑杨的速生分子调控机制奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 赤霉素合成及信号转导途径
• 1.1.1 赤霉素生物合成途径及反馈调节
• 1.1.2 赤霉素信号应答机制
• 1.1.2.1 赤霉素信号途径中的主要组分
• 1.1.2.2 赤霉素受体
• 1.1.2.3 DELLA蛋白降解的分子机制
• 1.1.2.4 赤霉素信号转导模式
• 1.2 赤霉素与植物生长发育相关研究进展
• 1.3 GA 20-氧化酶与植物生长发育相关研究进展
• 1.4 GASA基因家族研究进展
• 1.4.1 GASA基因蛋白结构与组织表达模式
• 1.4.2 GASA基因在植物生长发育中的作用
• 1.5 杨树遗传转化体系的研究
• 1.5.1 杨树遗传转化的方法
• 1.5.2 杨树遗传转化的影响因素
• 1.6 研究目的及意义
• 1.6.1 目的及意义
• 1.6.2 技术路线
• 2 PdGA20ox基因的克隆及功能的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 总RNA的提取
• 2.1.2.1 实验器皿和耗材的处理
• 2.1.2.2 药品的制备
• 2.1.2.3 RNA提取步骤
• 2.1.3 GA20-氧化酶基因的克隆及蛋白结构分析
• 2.1.3.1 PCR扩增
• 2.1.3.2 目的片段的纯化回收
• 2.1.3.3 目的片段与pMD18-T载体连接
• 2.1.3.4 转化大肠杆菌感受态
• 2.1.3.5 PCR检测大肠杆菌阳性克隆
• 2.1.3.6 PdGA20ox基因的蛋白结构分析
• 2.1.4 植物表达载体的构建及转化农杆菌
• 2.1.4.1 基因5’端加入酶切位点
• 2.1.4.2 目的条带纯化回收与T载体连接
• 2.1.4.3 转化大肠杆菌进行PCR鉴定
• 2.1.4.4 质粒的提取
• 2.1.4.5 酶切及连接表达载体
• 2.1.4.6 根癌农杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.1.4.7 农杆菌菌液PCR检测
• 2.1.5 GA20-氧化酶基因转化拟南芥
• 2.1.5.1 拟南芥的培养
• 2.1.5.2 农杆菌转化拟南芥
• 2.1.6 转基因拟南芥的筛选和鉴定
• 2.1.6.1 甘露糖筛选
• 2.1.6.2 氯酚红检测
• 2.1.6.3 GUS组织化学法染色检测
• 2.1.6.4 PCR检测转基因植株
• 2.1.6.5 转基因株系目的基因相对表达量
• 2.1.7 超表达PdGA20ox、ATGA20ox1基因的株系相关表征分析
• 2.1.7.1 萌发率的测定
• 2.1.7.2 拟南芥下胚轴及根的测定
• 2.1.7.3 叶面积的测定
• 2.1.7.4 株高和地径的测定
• 2.1.8 PdGA20ox基因在欧美杨R270中的表达情况
• 2.1.8.1 欧美杨R270组培苗的扩繁
• 2.1.8.2 欧美杨R270组培苗的赤霉素处理
• 2.1.8.3 RNA提取和半定量PCR反应
• 2.2 结果
• 2.2.1 GA 20-氧化酶基因的克隆
• 2.2.2 PdGA20ox与ATGA20ox1基因序列分析
• 2.2.3 PdGA20ox蛋白结构分析
• 2.2.4 植物表达载体的构建及转化农杆菌结果
• 2.2.5 转基因拟南芥的筛选和鉴定
• 2.2.5.1 甘露糖筛选
• 2.2.5.2 氯酚红检测
• 2.2.5.3 GUS组织化学法染色检测
• 2.2.5.4 PCR检测转基因植株
• 2.2.5.5 PdGA20ox和ATGA20ox1在转基因拟南芥中的表达量
• 2.2.6 超表达PdGA20ox、ATGA20ox1基因的拟南芥株系相关表征分析
• 2.2.6.1 萌发率的测定
• 2.2.6.2 胚轴和根长的测定
• 2.2.6.3 叶面积的测定
• 2.2.6.4 株高和地径的测定
• 2.2.7 PdGA20ox基因在欧美杨R270中的表达
• 2.3 讨论
• 2.3.1 GA 20-氧化酶基因的克隆
• 2.3.2 转基因拟南芥的筛选和鉴定
• 2.3.3 PdGA20ox基因的功能研究
• 3 PdGASA基因的克隆及功能的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 PdGASA基因克隆及分析
• 3.1.3 PdGASA基因的表达特征及对激素的响应
• 3.1.3.1 欧美杨R270组培苗的激素处理
• 3.1.3.2 RNA提取和半定量PCR反应
• 3.1.4 PdGASA基因表达载体的构建与转化农杆菌
• 3.1.5 PdGASA基因转化拟南芥及转化植株的筛选鉴定
• 3.1.6 超表达PdGASA基因的拟南芥相关表征分析
• 3.1.6.1 萌发率的测定
• 3.1.6.2 拟南芥根长、叶面积和株高的测定
• 3.1.6.3 PdGASA基因在细胞中的定位
• 3.2 结果
• 3.2.1 PdGASA基因的克隆
• 3.2.2 PdGASA基因序列分析
• 3.2.3 PdGASA基因响应激素的元件分析
• 3.2.4 PdGASA基因表达特征及对激素的响应
• 3.2.4.1 PdGASA基因在欧美杨R270各器官中的表达情况
• 3和ABA的响应'>3.2.4.2 PdGASA基因对GA₃和ABA的响应
• 3.2.5 PCR检测PdGASA基因表达载体
• 3.2.6 转基因拟南芥的筛选和鉴定
• 3.2.7 超表达PdGASA1基因的拟南芥相关表征分析
• 3.2.8 超表达PdGASA2基因的拟南芥相关表征分析
• 3.2.9 超表达PdGASA4基因的拟南芥相关表征分析
• 3.3 讨论
• 4 PdGA20ox和PdGASA基因在欧美杨R270中的转化
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 甘露糖敏感性实验
• 4.1.3 欧美杨R270转化
• 4.1.4 转化欧美杨R270的筛选和鉴定
• 4.2 结果
• 4.2.1 甘露糖抗性的选择
• 4.2.2 欧美杨R270转化后的生长情况
• 4.2.3 转基因欧美杨R270生根情况
• 4.2.4 转基因欧美杨R270的筛选和鉴定
• 4.3 讨论
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 5.3 展望
• 参考文献
• 缩略词表
• 个人简介
• 导师简介
• 获得成果目录清单
• 致谢