核盘菌草酸脱羧酶基因抗菌核病潜能研究

论文摘要

由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary)引起的菌核病(White mold)是造成农作物减产,特别是油料作物减产的一种重要病害。菌核病对世界上大豆,油菜,向日葵等油料作物的生产造成了巨大损失。一些植物中虽然存在针对核盘菌的数量抗性性状,但是到目前为止还没有发现完全基因抗性性状的存在,这给培育抗病新品种带来了巨大困难。近几年随着转基因技术的发展,人们期望使用转基因技术来增强核盘菌寄主对核盘菌的抗性,寻找可以利用的基因资源迫在眉睫。鉴于草酸在核盘菌致病中的重要作用,本研究以模式生物拟南芥和世界上最重要的油料作物油菜和大豆为基础,通过农杆菌介导的植物转化的方法,分别采用组成型表达和病毒介导表达的方式来评价一个来自病原菌自身的草酸脱羧酶基因的抗病潜力,并对其效果与现在人们最熟知的草酸氧化酶做了横向比较。试验表明当拟南芥表达草酸脱羧酶时,有一半以上的植株表现出对菌核病的抗性。同时在病毒介导的表达中,大豆阴性对照组更加感病,可能病毒的表达抑制了植物的抗病反应,试验组相比之下表现出了一定的抗性,但在油菜上却没有观察到任何效果。综合以上结果我们推测,草酸脱羧酶在一定程度上可以提高植物对菌核病的抗性。这是首次证明病原菌中的基因也可以作为植物抗病育种的基因资源,从而开阔了基因筛选的范围。在评价过程中我们充分考虑了在研究草酸脱羧酶时人们最关心的一个问题,即草酸脱羧产物—甲酸是否会对草酸脱羧酶基因抗病造成负面影响。试验发现,甲酸与草酸有截然不同的作用方式,草酸可以沿着伤口和细胞间隙扩散,并杀死细胞,而甲酸则是腐蚀接触到的细胞组织,扩散能力相对较弱。当甲酸与草酸同时存在于病斑边缘时,甲酸因为扩散能力的影响不会对草酸脱羧酶的抗病能力造成负面影响。综上所述,核盘菌草酸脱羧酶基因能够在一定程度上提高植物抗菌核病的能力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1. 核盘菌及菌核病
• 2. 菌核病的防治
• 3. 草酸是抗菌核病转基因育种的重要靶标
• 3.1 草酸是核盘菌致病过程中重要的致病因子
• 3.2 草酸在植物中的生物学意义
• 3.3 代谢草酸的酶类
• 3.3.1 草酸氧化酶
• 3.3.2 乙酰CoA脱羧酶
• 3.3.3 草酸脱羧酶
• 3.4 草酸降解酶在转基因中的研究进展
• 4. 本研究的目的意义
• 第二章 核盘菌草酸脱羧酶基因抗菌核病潜能评价体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 核盘菌中的草酸脱羧酶基因
• 1.2 酶与引物设计
• 1.3 核盘菌草酸脱羧酶基因的克隆及组成型表达载体的构建
• 1.3.1 菌丝的培养与收集
• 1.3.2 RNArose抽提总RNA
• 1.3.3 RT-PCR克隆草酸脱羧酶基因编码区全长
• 1.3.4 草酸脱羧酶基因编码区全长的纯化回收
• 1.3.5 草酸脱羧酶基因编码区全长连接T载体与转化大肠杆菌
• 1.3.6 碱裂解法抽提质粒T-OXDC
• 1.3.7 大豆DNA的抽提
• 1.3.8 异黄酮合成酶Ⅰ非编码区的克隆
• 1.3.9 草酸脱羧酶组成型表达载体的组建
• 1.4 核盘菌草酸脱羧酶基因病毒介导表达载体的构建
• 1.5 农杆菌的电击转化
• 1.6 拟南芥草酸脱羧酶组成型表达的建立
• 1.6.1 拟南芥的种植
• 1.6.2 拟南芥的转化
• 1.6.3 拟南芥转化子的鉴定
• 1.6.4 拟南芥转化子的抗病性评价
• 1.7 大豆的转化
• 1.7.1 培养基的配制
• 1.7.2 大豆品种的选择
• 1.7.3 大豆转化基本步骤
• 1.8 大豆、油菜草酸脱羧酶病毒介导表达的建立
• 1.8.1 植株与农杆菌的的准备
• 1.8.2 大豆、油菜的处理
• 1.8.3 病毒介导表达oxdc的大豆与油菜抗病性评价
• 1.9 甲酸对植物的毒性
• 1.10 甲酸对核盘菌的毒性
• 2 结果与分析
• 2.1 核盘菌草酸脱羧酶基因的克隆
• 2.2 拟南芥转化子的鉴定与抗病性评价
• 2.3 大豆的转化
• 2.4 病毒介导表达oxdc的大豆与油菜的抗病性评价
• 2.4.1 大豆的抗病性评价
• 2.4.2 油菜的抗病性评价
• 2.5 甲酸对植物的毒性
• 2.6 甲酸对核盘菌的毒性
• 3 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢