论文摘要
磷脂酶C是细胞信号转导通路中的一个关键酶,磷脂酶C-zeta （PLCz）是其五种亚型中的一种。PLCz在睾丸组织中特异性表达,可引起卵细胞发生Ca2+振荡并激活卵子,同时在顶体反应、受精及胚胎发育过程中发挥着巨大作用。因而本研究拟通过分析PLCz基因分子遗传变异特性以及对公牛精液品质的影响,为标记辅助选择高繁殖力公牛提供理论依据。1. PLCz基因启动子活性分析本实验选取北京奶牛中心、上海光明荷斯坦牧业有限公司和山东奥克斯生物技术有限公司等3个种公牛站的424头中国荷斯坦公牛个体作为试验材料,提取了种公牛精液中的全基因组DNA,运用DNA测序、PCR-RFLP技术对PLCz基因的全序列进行了单核苷酸多态性分析。通过对PLCz基因5’侧翼区测序分析发现两个新的多态位点g.-456 G>A和g.+65 T>C。以424头中国荷斯坦公牛个体为实验对象,通过与公牛精液品质相关性分析,结果表明这两个SNPs以及他们的单倍型组合均与公牛的精液品质存在显著相关性。通过生物信息学软件预测,发现这两个多态位点均位于PLCz基因的核心启动子区,推测可能与启动子区的转录表达调控相关。利用双荧光素酶报告基因检测系统分析牛PLCz基因的5’侧翼区启动子活性,发现726 bp（-641nt～+112 nt）区域为其核心启动子区。此外,将H1H1（GTGT）, H2H2 （GCGC）, H3H3 （ATAT）和H4H4 （ACAC）四种单倍型组合分别转染到小鼠的睾丸间质细胞瘤细胞（MLTC-1）。结果发现不同的单倍型转染的荧光活性存在显著性差异,H2H2单倍型的荧光活性在细胞中的表达量最高。故而,我们推测位于启动子区的这两个新的SNPs可能与启动子区的转录因子的结合相关,从而影响了PLCz基因启动子区的表达和调控。2. PLCz基因可变剪切体的寻找利用RT-PCR和克隆测序技术,发现在睾丸组织中存在一种新的转录本形式,为外显子10的3’端缺失16 bp个碱基的可变剪切体即PLCz-sv1,全转录本命名为PLCz-complete。通过实时荧光定量PCR分析表明,这两种转录本在成年牛与初生牛中均有所表达,然而他们的相对表达量却存在极显著差异。通过在线软件和网站预测分析,发现这种新的转录本由于第453th～457th氨基酸的缺失导致了转录的提前终止以及蛋白的空间结构发生了明显的变化。故而,这种新的剪切体的出现可能会使牛PLCz基因的表达及其功能发生巨大的改变。3. PLCz基因多态性与奶牛精液品质性状关联性分析运用DNA测序、PCR-RFLP技术对424头中国荷斯坦公牛个体PLCz基因的全序列进行了单核苷酸多态性分析。实验发现了8个新的SNPs位点,其中g.27529T>A和g.27597T>C位于内含子7区,g.47969G>A,g.48020 T>C,g.48079 G>A,g.48127 G>T与g.48384 G>T位于内含子12区,而位于外显子8区的多态位点g.27768 G>C发生突变后可以导致第337位的丙氨酸突变为脯氨酸,故而此突变为非同义突变。此外,连锁不平衡分析表明在研究的群体中g.27529 T>A、g.27597 T>C和g.27768 G>C（SNP1）三个位点完全连锁,g.47969G>A、g.48020 T>C、g.48079 G>A、g.48127 G>T和g.48384 G>T（SNP2）五个位点完全连锁。通过与公牛精液品质相关性分析表明,SNP2位点与精子畸形率显著相关（P<0.05）。基于试验群体中SNP1和SNP2两个多态位点构建出四种单倍型：CA,CB,TA,TB。进而构建出九种不同的单倍型组合：CCAA, CTAA, TTAA, CCAB, CTAB, TTAB, CCBB, CTBB和TTBB。实验表明这九种单倍型组合与公牛精液品质性状显著相关,单倍型组合TTAB个体的射精量（P<0.05）、鲜精密度（P0.01）和冻后活力（P<0.05）显著高于其他单倍型组合个体,鲜精活力显著高于单倍型组合TTBB个体（P<0.05）,畸形率则显著低于单倍型组合CTAB个体（P<0.05）。结果表明,单倍型组合TTAB可作为中国荷斯坦公牛高精液品质的有效分子标记。