H5N1亚型高致病性禽流感病毒单链抗体的构建

论文摘要

禽流感（AI）是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒（Avian Influenza virus,AIV）引起的禽类烈性传染病,被世界动物卫生组织（OIE）列入OIE疫病名录（OIE-Listed diseases）,为必须申报的动物传染病。高致病性H5N1禽流感病毒自1997年在香港首次爆发并致死六人以来,2003年底至今又在东南亚和中亚地区持续大规模爆发除造成382人感染241死亡外其造成的危害还严重打击了相关各国的农业经济造成国民经济的惨重损失。对于H5N1禽流感病毒的治疗性研究正逐渐受到各国的重视,金刚烷胺、扎那米韦和奥司米韦等流感抑制剂的相继问世。自从1975年Milstein和Kohler成功建立了单克隆抗体技术以来,在疾病治疗领域单克隆抗体发挥了越来越重要的作用。但是,鼠源性单抗在人体使用后可产生人抗鼠抗体反应,而且单克隆抗体分子量大,不能有效进入病灶部位,临床使用受到限制。单链抗体（singlechain antibody,ScFv）是由一条连接肽将IgG分子的重链和轻链可变区连接而成,减少了免疫原性,分子小,实体组织穿透力强,血浆半衰期短,因而在临床疾病的诊断和治疗中具有重要的应用价值。本研究选代表性病毒株A/Goose/HLJ/QFY/03（H5N1）作为抗H5型单抗制备的免疫原,将其HA基因克隆到真核表达载体pCI-neo中构建了重组质粒pCI-HA,将pCI-HA转染Vero E6细胞,48h后对转染细胞进行免疫组化实验,结果表明pCI-HA具有表达活性。使用纯化的pCI-HA作为质粒免疫源免疫8周龄Balb/c小鼠,通过纯化的病毒AB38作为ELISA反应的包被抗原,筛选出阳性克隆。然后,对ELISA实验为阳性的样本再进行HI实验筛选,得到三株ELISA反应为强阳性,并且具有血凝抑制活性的细胞克隆,分别命名为3F7、1D7和3E4。选取3F7进行亚克隆,经过四轮亚克隆获得一株具有高血凝抑制活性单克隆细胞株3F7。3F7的小鼠腹水HI效价为16000,细胞上清中HI效价为128。亚类鉴定为重链为IgG1,轻链为κ链。提取3F7的细胞总RNA,通过RT-PCR得到单克隆抗体的VH和VL基因,并将VH和VL克隆到pMD18T载体中进行测序。通过在NCBI数据库进行序列分析比对确认得到了3F7单克隆抗体的VH和VL基因。并在IMGT/V-QUEST数据库中对得到的3F7 VH和3F7VL基因的抗体决定区（complementary determinant region,CDR）进行确定,应用SOE PCR方法,将重链和轻链基因通过一条柔性肽键连接,得到3F7-ScFv。将3F7-ScFv基因插入到pET30a载体中,构建了pET30a-3F7-HL原核表达系统,经酶切和测序鉴定结果正确,3F7-VH CDR1:GYTFTETY、3F7-VH CDR2:IYPMNGGT、3F7-VHCDR3:ARKLSLDY、3F7-VL CDR1:QSLLNSTNQKNY、3F7-VL CDR2:FAS、3F7-VLCDR3:QQHYSPPPT。将pET30a-3F7-HL重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞DE3,然后诱导表达。纯化复性后经过SDS-PAGE电泳,在31kD处出现目的条带,与预期结果相符。经与多株H5亚型禽流感病毒进行HI实验和中和实验证明该抗体蛋白具有血凝抑制活性和病毒中和活性。具有血凝抑制活性单链抗体的构建与表达为H5N1亚型禽流感病毒感染的抗病毒治疗性研究提供了实验支持,并为H5N1亚型高致病性禽流感的防治提供了新的技术手段。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 禽流感病毒的研究进展
• 1.1.1 流感病毒的生物性质
• 1.1.2 流感病毒的形态与结构
• 1.1.3 临床症状和病理变化
• 1.1.4 流感病毒蛋白的功能
• 1.1.5 流感病毒的变异
• 1.1.6 H5N1亚型流感病毒在我国的起源、分布和扩散
• 1.2 基因工程抗体的研究进展
• 1.2.1 单链抗体的产生
• 1.2.2 单链抗体的结构特点
• 1.2.3 单链抗体的来源
• 1.2.4 单链抗体研究进展
• 1.3 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒与菌株
• 2.1.2 试验动物及细胞系
• 2.1.3 试验所用毒株
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 流感病毒株的选择
• 2.2.2 DNA疫苗的制备
• 2.2.3 Balb/c小鼠的免疫程序
• 2.2.4 抗原制备
• 2.2.5 杂交瘤细胞株的建立
• 2.2.6 鼠单抗轻链和重链可变区的克隆
• 2.2.7 3F7 ScFv基因构建
• 2.2.8 pET30a-3F7-HL重组质粒构建
• 2.2.9 单链抗体蛋白的表达
• 2.2.10 3F7 ScFv蛋白的HI效价测定
• 2.2.11 3F7 ScFv蛋白中和活性测定
• 3 结果
• 3.1 杂交瘤细胞株的制备
• 3.1.1 H5N1亚型免疫毒株的选择
• 3.1.2 纯化抗原的蛋白含量测定
• 3.1.3 HA基因的PCR扩增和测序结果
• 3.1.4 重组质粒pCI-HA双酶切鉴定结果
• 3.1.5 重组质粒pCI-HA瞬时表达结果
• 3.1.6 杂交瘤细胞的制备
• 3.1.7 3F7杂交瘤细胞间接ELISA结果
• 3.1.8 3F7杂交瘤细胞培养上清及腹水效价
• 3.1.9 单克隆抗体的纯化
• 3.1.10 杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体的稳定性
• 3.1.11 单克隆抗体的亚类
• 3.1.12 单克隆抗体细胞染色体分析
• 3.2 pCI-3F7-HL表达系统的构建
• 3.2.1 VH和VL基因的PCR扩增
• 3.2.2 重组质粒pMD18T-3F7-VH和pMD18T-3F7-VL酶切鉴定结果
• 3.2.3 pMD18T-3F7 VH和pMD18T-3F7 VL基因序列分析
• 3.2.4 3F7 ScFv构建结果
• 3.2.5 pET30a-3F7-HL重组质粒的酶切鉴定结果
• 3.2.6 pET30a-3F7-HL重组质粒基因序列分析
• 3.2.7 3F7 ScFv表达及纯化结果
• 3.2.8 3F7 ScFv血凝抑制试验结果
• 3.2.9 3F7 ScFv病毒中和实验结果
• 4 讨论
• 4.1 关于杂交瘤细胞株的建立
• 4.2 3F7-HL-pET单链抗体原核表达系统的构建
• 4.2.1 ScFv基因序列的分析
• 4.2.2 3F7ScFv免疫学活性
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文