论文摘要
背景目前，脑中风治疗的药物和方法有限且效果欠佳。脑缺血可诱发海马神经元丢失从而导致空间学习和记忆能力受损。虽然脑缺血后大脑中侧脑室室下区和海马齿状回中神经干/祖细胞持续不断的增殖，但是神经再生的作用仍存在争议。脑缺血后新生的神经元可以向缺血部位发生迁移、分化、成熟后可整合入大脑回路中发挥作用，因此神经再生被认为是成年哺乳动物体内存在的一种内源性的修复机制，促进内源性神经再生治疗缺血性中风为脑保护策略提供了新的干预靶点。硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx）是一分子量为12kD的控制还原/氧化状态和细胞增殖/生存的小分子蛋白质，通过其二硫醇-二硫化物的活性位点，参与机体细胞增殖、调节氧化还原状态以及发挥抗凋亡作用等过程。因此，Trx系统被认为是除谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）系统之外的另一内源性抗氧化系统。哺乳动物机体内存在三种形式的Trx，胞质型Trx-1、线粒体型Trx-2以及精细胞中存在的一种Trx变体SpTrx/Trx3，其中Trx-1是机体内的主要形式，当脑缺血发生时可以诱导内源性Trx-1生成，减轻氧化损伤。作为一种抗氧化剂，在脑缺血模型中外源性给予人重组硫氧还蛋白（rhTrx-1）可以穿透血脑屏障发挥抗凋亡作用。除了其氧化还原酶的活性之外，近年来有研究发现rhTrx-1也可促进人体脂肪组织源性的间充质干细胞和血管生成。因此我们推测，rhTrx-1可以通过促进海马齿状回神经干细胞再生，改善全脑缺血后空间学习和记忆能力下降，产生脑保护作用。本实验利用小鼠全脑缺血模型和海马神经元离体培养，运用行为学、免疫组织化学及Western Blot等技术，对rhTrx-1的促神经再生作用进行研究，探讨其机制可能与rhTrx-1可以促进神经干细胞增殖和向神经元方向分化作用有关，揭示MEK/ERK信号通路可能参与了rhTrx-1的促神经再生作用，初步构建了rhTrx-1促神经再生作用与MEK/ERK信号通路间的相互关系，为将rhTrx-1应用于临床治疗脑中风提供新的理论依据。实验一rhTrx-1对小鼠全脑缺血后认知功能的影响【目的】探讨rhTrx-1对脑缺血小鼠学习和记忆能力的影响，为其机制研究奠定基础。【方法】采用双侧颈总动脉夹闭方法，制作小鼠全脑缺血BCCAO模型。1.8-12周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠（18-22g），由第四军医大学动物实验中心提供，随机分为3组（n=5）:假手术组（sham组）、缺血+溶剂组（CI+vehicle组）、缺血+人重组硫氧还蛋白治疗组（CI+rhTrx-1组），rhTrx-1及vehicle均在BCCAO再灌前10min通过腹腔注射方式给予，于再灌注72h后行Nissl染色，在高倍镜下观察海马CA1区神经元受损情况并对各组间存活的健康神经元数目进行计数。2.8-12周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠（18-22g），随机分为3组（n=8）: sham组、CI+vehicle组、CI+rhTrx-1组，于再灌注后30d进行行为学观察，观察指标为旷场实验和Morris水迷宫测试。3.为排除麻醉药物吸入过程可能会造成的低氧血症或是高碳酸血症的发生，单独使用3组实验动物（n=5）：sham组、CI+vehicle组及CI+rhTrx-1组行左颈总动脉置管。每只小鼠分别在BCCAO即刻和再灌注即刻自颈总动脉取血约0.2ml进行动脉血气测定。【结果】1.血气分析：结果显示不同组间双侧颈总动脉夹闭即刻和再灌注即刻动物动脉血气分析无统计学差异，排除低氧血症影响。2.Nissl染色结果：CI+vehicle组与CI+rhTrx-1组健康神经元数目较sham组相比均明显降低（P <0.01）；而CI+rhTrx-1健康神经元较CI+vehicle组数量增加（P <0.01）。3.旷场实验：结果显示活动总路程及中央区活动时间两检测指标各组间均无统计学差异（P>0.05），说明脑缺血并没有影响小鼠自主运动能力。4. Morris水迷宫：实验结果表明，与CI+vehicle组相比，CI+rhTrx-1组小鼠空间学习和记忆能力明显提高，游泳总路程和游泳速度各组间没有统计学差异说明小鼠认知能力的改善并不是因为肌力下降所引起的。【结论】 rhTrx-1可以改善脑缺血后小鼠空间学习和记忆能力。实验二rhTrx-1对脑缺血后海马齿状回神经再生的影响【目的】探讨rhTrx-1对脑缺血后海马齿状回神经再生作用的影响，建立认知功能与神经再生之间的联系。【方法】8-12周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠（18-22g），随机分为3组（n=12）:sham, CI+vehicle组和CI+rhTrx-1组，分别于BCCAO再灌注后14d进行BrdU/Hoechst、Ki67/Hoechst和DCX免疫荧光染色检测rhTrx-1对脑缺血后海马神经干细胞增殖作用的影响；于BCCAO再灌注后30d进行BrdU/NeuN免疫荧光染色，检测rhTrx-1对脑缺血后海马神经干细胞增殖作用的影响。【结果】海马齿状回神经干细胞增殖情况：1. BrdU和Ki67染色结果。CI+vehicle组BrdU+细胞较Sham组相比增加至约1.5倍（P <0.05）；较CI+vehicle组相比CI+rhTrx-1组BrdU+细胞数增加显著（P <0.01）。同样，较Sham组相比CI+vehicle组Ki67+细胞增加明显（P <0.05），并且在CI+rhTrx-1组Ki67+细胞数增加至约2倍（P <0.01）。2. DCX染色结果。较CI+vehicle组相比海马齿状回中CI+rhTrx-1组DCX+细胞数明显增加（P <0.01）。海马齿状回神经干细胞分化情况：BrdU+/NeuN+染色结果。CI+rhTrx-1组BrdU+细胞较CI+vehicle组明显增加（P <0.01），表示rhTrx-1可促进新生神经元数目的增加及存活；但是，免疫荧光双标染色显示，与CI+vehicle组相比BrdU+/NeuN+与BrdU+的比例却没有变化（P>0.05），说明rhTrx-1对缺血后海马齿状回神经干细胞分化没有影响。【结论】 rhTrx-1可以促进小鼠全脑缺血后海马齿状回神经干细胞增殖，但对其分化没有影响。实验三rhTrx-1对离体培养神经干细胞再生的影响及机制研究【目的】探讨rhTrx-1对离体培养神经干细胞再生的影响，明确其相关机制。【方法】清洁级孕14-16d的Sprague-Dawley（SD）大鼠，由第四军医大学实验动物中心提供，进行原代海马神经干细胞培养、鉴定和传代。1.离体培养神经干细胞分为5组：Vehicle,1,10,50,100μg/ml rhTrx-1组，48h后观察在不同浓度rhTrx-1作用下神经干细胞的增殖情况。2.离体培养神经干细胞分为5组：Vehicle,1,10,50,100μg/ml rhTrx-1组，7d后观察在不同浓度rhTrx-1作用下神经干细胞的分化情况。3.离体培养神经干细胞分为4组：0h，2h，24h，48h组，48h后观察在10μg/mlrhTrx-1作用下不同时间点神经再生相关信号通路MEK/ERK和PI3K/Akt表达变化情况。4.离体培养神经干细胞共为4组：Vehicle, rhTrx-1, U0126, rhTrx-1+U0126组，观察MEK/ERK信号通路抑制剂---U0126对rhTrx-1促神经干细胞增殖（培养48h）和分化（培养7d）作用的影响。【结果】1.离体培养神经干细胞鉴定：免疫荧光染色结果显示无论是克隆球还是单个神经干细胞均表达神经干细胞的标记物---巢蛋白。2.离体培养神经干细胞增殖情况：1).细胞活力检测结果显示：10,50,100μg/ml rhTrx-1组细胞活力较Vehicle组相比明显增加（P <0.01），三组浓度间相比无统计学差异。2). BrdU和Ki67免疫荧光染色结果：10,50,100μg/ml rhTrx-1组BrdU+细胞数目明显增加（P <0.01）；1，10,50μg/ml rhTrx-1组Ki67+细胞数目明显增加（1μg/ml P <0.05；10,50μg/mlP <0.01）。3.离体培养神经干细胞分化情况：1). Tuj1和GFAP免疫荧光染色结果：与Vehicle组（7.21%）相比，1,10μg/ml rhTrx-1组Tuj1+细胞数目明显增加（1μg/ml P <0.05，13.51%；10μg/ml P <0.01，18.08%）；同样，1,10μg/ml rhTrx-1组GFAP+细胞数目明显降低（P <0.05）。2). Western Blot分析结果同样表明：10μg/mlrhTrx-1组Tuj1表达量增加约1.5倍（P <0.05），GFAP的表达量在10μg/mlrhTrx-1组也明显下降（P <0.05）。4. MEK/ERK而不是PI3K/Akt信号通路参与rhTrx-1的促神经再生作用： Western Blot结果显示rhTrx-1加入2h后pERK表达开始增加（P <0.05）,直至48h仍能维持较高水平（P <0.01）；而pAkt表达无明显变化（P>0.05）。5. MEK/ERK信号通路抑制剂---U0126抑制了rhTrx-1的促神经再生作用：1). Western Blot结果显示U0126可以抑制rhTrx-1促进的pERK表达增加（P <0.05）。2).免疫荧光染色的结果显示U0126可以抑制rhTrx-1促进的BrdU+（P <0.05）和Tuj1+（P <0.01）细胞数目增加。【结论】rhTrx-1可以促进离体培养神经干细胞增殖和分化作用，并且MEK/ERK而不是PI3K/Akt信号通路参与了rhTrx-1的促神经再生作用。总结我们研究发现，外源性给予rhTrx-1可以促进小鼠全脑缺血后海马齿状回神经再生，改善脑缺血后小鼠空间学习和记忆能力，发挥神经保护作用。其机制可能与rhTrx-1可以促进神经干细胞增殖和分化作用有关，并且MEK/ERK信号通路参与了rhTrx-1的促神经再生作用，初步构建了rhTrx-1促神经再生作用与MEK/ERK信号通路间的相互关系，为将rhTrx-1应用于临床治疗脑中风提供了新的理论依据。
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