重组人心肌肌红蛋白基因工程菌的构建及重组蛋白的初步纯化

论文摘要

肌红蛋白（myoglobin,Mb）是与血红蛋白相似的血红素蛋白质,是横纹肌组织特有的色素蛋白,分子量为17KD。约占肌肉蛋白质总量的0.1%～0.2%,其分子结构和血红蛋白的亚基相似,由1条多肽链和1个血红素分子构成。人的Mb肽链含153个氨基酸,其结构排列与血红蛋白的n链非常相似。肌红蛋白（Mb）用于心肌损伤检测的生化标志物已近30年。目前仍普遍用作急性心肌梗死（AMI）的早期渗断。AMI时,损伤的心肌细胞释放Mb入血,在症状发生后1～2 h,血清Mb即异常升高。4～8 h达最高值,72 h后恢复至正常。心电图（ECG）是早期诊断AMI的较可靠检查方法。长期的临床实践证实,如果将Mb与ECG同时应用,可提高AMI早期诊断率。有研究结果表明,胸痛患者同时进行ECG检查和Mb测定,AMI的诊断率可由单用ECG的62%提高到82%。但是,目前临床上应用的Mb诊断试剂盒多为国外进口,价格昂贵,限制了Mb在临床上早期诊断中的广泛应用。研制成功具有自主知识产权,完全国产化的Mb诊断试剂盒是当前急需。在研究中发现试剂盒的重要组成成分Mb抗原的来源问题严重制约着Mb试剂盒的国产化进程。传统的方法是从心肌组织中采用生化方法提取,但目前人心肌组织的来源极其困难,且质量也难以保证,致使其产率极低,抗原活性也不理想。因此我们利用基因工程技术构建稳定、高效表达人肌红蛋白的基因工程菌,获得高纯度的Mb,为今后开展Mb珍断试剂盒国产化研究奠定坚实的基础。本研究的目的是构建稳定、高效表达重组人心肌肌红蛋白的基因工程菌株,并初步纯化重组蛋白以达到制备单克隆抗体的要求,为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料,促进心肌肌红蛋白诊断标准化的研究。设计引物时将上下游引物的两端分别插入NdeⅠ内切酶位点和HindⅢ内切酶位点,可使目的基因准确的插入pET21a（+）表达载体,并简化了cDNA克隆阶段的操作。采用RT—PCR方法从人心肌组织总RNA中克隆出全长的人心肌肌红蛋白基因,将其插入到pMD18—T simple克隆载体中,转化E.coli DH5α,经酶切和测序对目的基因分析,再插入到pET-21a（+）表达载体中,转化BL21（DE3）,对诱导表达的目的蛋白行SDS-PAGE和采用锐普（?）心梗仪检测重组蛋白的抗原性并准确定量。通过硫酸铵沉淀法以及透析法对重组蛋白进行初步纯化,使其可以达到单克隆抗体制备所需的抗原纯度。克隆了全长的肌红蛋白基因,目的蛋白表达量达菌体总蛋白的15%,重组蛋白抗原性良好,抗原纯度为80%,达到制备单克隆抗体所需纯度。综上所述,成功构建稳定、高效表达重组人心肌肌红蛋白的基因工程菌,并初步纯化出目的蛋白。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、正文
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献及主要参考书目
• 附件
• 四、综述
• 五、缩略词
• 六、在读期间发表的文章
• 七、致谢