东乡野生稻基因组双元细菌人工染色体（BIBAC2）文库的构建

论文摘要

BIBAC载体设计的具有许多优于YAC和PAC的方面。它不会出现重组交换而导致的基因嵌合现象,可以在大肠杆菌和农杆菌中进行穿梭;在农杆菌介导下能直接将外源基因整合到植物基因组中,一旦获得目标阳性克隆后,不需要进行亚克隆就可以直接转化植物,进行功能互补实验;验证功能后含有目的基因的克隆,即使基因结构未知,也可直接进行植物转基因育种工作,加速分子育种的研究进程。 东乡野生稻（2n=24）是世界纬度最北（位于东经116°36′,北纬28°14′）的普通野生稻,它在-12.8～0℃低温条件下仍能安全越冬,具宿根（多年生）,再生力和繁殖（无性）力强,耐旱、耐贫瘠及多种抗逆性等各种有利性状及含胞质不育基因、广亲和基因、恢复基因、抗病虫基因等多种有利基因。 本研究在参考了前人BIBAC、TAC和BAC文库构建方法的基础上,通过改进建立了一套可转化大片段文库构建技术体系。包括载体的制备、高分子量DNA的提取、酶切条件的确定、片段大小的选择、目的大片段的回收、连接及转化体系,最终获得了所需大小的插入片段,重组率高的BIBAC文库构建体系。 利用所建立的BIBAC文库构建体系,以BIBAC2为载体,构建了东乡野生稻BIBAC2文库,选择野生稻幼嫩叶片,提取高分子量DNA,选择合适的酶量,选取50-100 kb左右范围的片段。到目前为止共获得了14 592个重组克隆,通过随机挑取26个克隆采用碱裂解法提取质粒,琼脂糖脉冲电泳结果表明空载率为7.8%,克隆重组率为92.2%平均插入片段为65 kb,覆盖东乡野生稻基因组2倍。对文库进行了稳定性测试,结果表明东乡野生稻基因组能够稳定的在BIBAC2中稳定存在。接种了四种水稻的成熟胚,在NB培

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.前言
• 1.1 植物基因组学的研究进展
• 1.1.1 拟南芥基因组研究进展
• 1.1.2 水稻基因组研究进展
• 1.2 植物基因克隆技术的发展
• 1.2.1 PCR扩增克隆
• 1.2.2 表型基因克隆法
• 1.2.3 定位克隆
• 1.2.4 同源序列克隆
• 1.3.植物基因组大片段DNA文库研究进展
• 1.3.1 Lambda噬菌体文库和Cosmid文库
• 1.3.2 酵母人工染色体（YAC）
• 1.3.3 细菌人工染色体（BAC）
• 1.3.4 P1克隆系统和源于P1的人工染色体（PAC）
• 1.3.5 双元细菌人工染色体（BIBAC）
• 1.3.6 可转化人工染色体（TAC）
• 1.4 本论文立题依据、研究内容、技术路线
• 2.材料与方法
• 2.1.材料
• 2.1.1 菌株、质粒
• 2.1.2 水稻材料
• 2.2.研究方法
• 2.2.1.质粒质量检测
• 2.2.2 BIBAC2质粒的酶切和去磷酸化
• 2.2.3 处理后载体质量的检测
• 2.2.4 电击转化
• 2.2.5 电击转化DH10B感受态的制备
• 2.2.6 东乡野生稻核高分子量DNA的制备
• 2.2.7 东乡野生稻核高分子DNA质量的检测
• 2.2.8 东乡野生稻核高分子量DNA限制性酶切条件的确定
• 2.2.9 高分子量核DNA的大量限制性酶切及高分子量DNA大片段的第一次分离
• 2.2.10 东乡野生稻核高分子量DNA大片段的第二次分离
• 2.2.11 东乡野生稻核高分子量DNA大片段的回收
• 2.2.12 载体与回收的外源片段的连接
• 2.2.13 单克隆的挑取及保存
• 2.2.14 文库中插入片段大小的检测
• 2.2.15 文库中插入片段稳定性的检测
• 2.3 水稻愈伤组织的转化
• 2.3.1 水稻成熟胚愈伤组织的诱导
• 2.3.2 农杆菌介导转化水稻愈伤组织
• 3.实验结果与分析
• 3.1.BIBAC2载体的检测
• 3.1.1 BIBAC2质粒的鉴定
• 3.1.2 BIBAC2质粒的浓度测定
• 3.1.3 质粒载体的酶切和去磷酸化
• 3.1.4 载体的连接测试
• 3.2 东乡野生大片段DNA的制备
• 3.2.1 东乡野生稻核基因组DNA的质量的鉴定
• 3.2.2 东乡野生稻核基因组DNA的酶切条件的确定
• 3.2.3 大量酶切后大片段的第一次分离
• 3.2.4 大片段的第二次分离
• 3.2.5 回收大片段及浓度测定
• 3.2.6 大片段和载体的连接及转化
• 3.3 文库质量的检测
• 3.3.1 插入片段大小的检测
• 3.3.2 插入片段在大肠杆菌中的稳定性检测
• 3.4 同一培养基上诱导的愈伤
• 3.5 农杆菌介导转化愈伤组织
• 4.讨论
• 4.1 构建BIBAC2文库的优势
• 4.2 对文库构建实验程序的优化
• 4.3 影响农杆菌介导水稻转化几个因素
• 参考文献
• 致谢
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4