拟南芥FHY3不同结构域在调节光敏色素A信号传导中的功能研究

论文摘要

高等植物在不断地进化过程中形成了一个光感受器的网络，从而可以感知光环境的变化，不断适应环境，促进自身的生长发育。在这些光感受器中，光敏色素（phy）是迄今为止研究最为清楚的一类光感受器，它以两种不同的形式存在，即红光吸收型（Pr）和远红光吸收型（Pfr）。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，存在五种光敏色素编码基因（PHY），即PHYA-PHYE。phyA是高等植物中调控远红光诱导反应的主要光接受体。随着分子生物学、遗传学等研究技术的不断发展，对模式植物拟南芥的大量研究，建立了phyA信号传导的框架。在黑暗中phyA以非活性的Pr形式位于细胞质中，用适当波长的光照射后，就转化成活性状态的Pfr转移到细胞核内调控基因的表达。FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYLS 3（FHY3）和FAR-RED-IMPAIREDRESPONSE 1（FAR1）是phyA信号途径中的调控因子，能够直接结合到FAR-REDELONGATED HYPOCOTYL 1（FHY1）和FHY1-like（FHL）的启动子上，激活它们的表达，而FHY1和FHL的蛋白产物，在phyA的进核途径中起着重要的作用。FHY3和FAR1与Mutator类转座酶具有大量的序列相似性，并且拥有相似的结构域，包括氮末端的C2H2型锌指结构域、核心转座酶结构域以及碳末端的SWIM模体。为进一步明确FHY3和FAR1在phyA信号传导途径中的作用，本论文对FHY3和FAR1之间部分重叠功能的分子机理以及FHY3不同结构域的具体功能进行探讨，取得如下结果：1．采用FHY3和FAR1启动子转换的手段，构建出FHY3p：：FHY3／fhy3-4、FAR1p：：FAR1／far1-2、FAR1p：：FHY3／far1-2、FAR1p：：FHY3／fhy3-4、FHY3p：：FAR1／far1-2和FHY3p：：FAR1／fhy3-4转基因植株，通过对表型特征的分析，研究发现这对同源基因的启动子活性和蛋白功能的差异性是两者之间具有部分重叠功能所必须的。2．采用点突变的手段研究阐明了FHY3不同结构域在phyA信号传导途径中发挥着十分重要的作用，具体如下：（1）通过酵母单杂交和电泳迁移率检测（EMSA）实验，并结合转基因植株的表型、生理特征以及FHY1／FHL表达水平的分析，证实了氮末端C2H2型锌指结构域对于FHY3在植物中发挥DNA结合功能有着至关重要的作用。（2）通过酵母单杂交和拟南芥原生质体转化实验，并结合转基因植株的表型、生理特征以及FHY1／FHL表达水平的分析，证实了核心转座酶结构域和碳末端的SWIM模体对于FHY3在植物体内发挥转录激活活性和生物学功能至关重要。（3）通过酵母双单杂交实验研究阐明了FHY3的核心转座酶结构域和碳末端的SWIM模体在蛋白质相互作用中必不可少，包括自身同源二聚体以及与FAR1异源二聚体的形成，而且FHY3二聚体的形成能力与其在细胞中的转录调控活性密切相关。（4）通过共聚焦显微镜（Confocal）检测转基因植株中黄色荧光蛋白（YFP）信号，进一步明确了FHY3和FAR1蛋白质定位于植物细胞核，而且发现保守氨基酸替换并不影响FHY3蛋白的核定位。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩写
• 目次
• 1 引言
• 1.1 植物光敏色素的研究进展
• 1.1.1 光敏色素分子基因
• 1.1.2 光敏色素分子特征
• 1.1.3 光敏色素的类型
• 1.1.4 光敏色素的反应方式
• 1.2 植物光敏色素信号传导的研究进展
• 1.2.1 光敏色素的核定位
• 1.2.2 光信号转导的核内调节因子
• 1.2.2.1 PIFs
• 1.2.2.2 HY5
• 1.2.2.3 COP1/SPA
• 1.3 植物光敏色素的生理功能
• 1.3.1 光敏色素在植物个体发育中的作用
• 1.3.2 光敏色素与光周期
• 1.3.3 光敏色素与昼夜节律钟
• 1.3.4 光敏色素与植物激素
• 1.4 PhyA信号传导作用因子FHY3/FAR1的研究进展
• 1.5 本论文的立题依据及研究内容
• 1.5.1 立题依据
• 1.5.2 研究内容
• 2 FHY3和FAR1在phyA的信号传导中的部分重叠功能
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 植物品种
• 2.2.2 菌株
• 2.2.2.1 大肠杆菌（Escherichia coli）
• 2.2.2.2 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）
• 2.2.3 质粒载体
• 2.2.4 试剂盒及酶
• 2.2.5 其他各类化合物
• 2.3 方法
• 2.3.1 载体构建
• 2.3.1.1 载体构建方法
• 2.3.1.2 载体具体构建步骤
• 2.3.2 大肠杆菌转化
• 2.3.2.1 感受态细胞制备
• 2.3.2.2 转化
• 2.3.3 农杆菌的转化
• 2.3.3.1 感受态细胞制备
• 2.3.3.2 转化
• 2.3.4 拟南芥基因组DNA提取
• 2.3.5 拟南芥总RNA的提取
• 2.3.5.1 普通方法
• 2.3.5.2 试剂盒方法
• 2.3.6 PCR反应
• 2.3.6.1 PCR反应体系
• 2.3.6.2 PCR反应条件
• 2.3.6.3 PCR引物序列
• 2.3.7 RT-PCR检测
• 2.3.8 Real-Time PCR检测
• 2.3.9 拟南芥种植
• 2.3.9.1 拟南芥无菌培养
• 2.3.9.2 拟南芥土壤种植
• 2.3.10 拟南芥转化
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 FHY3和FAR1的表达特征
• 2.4.2 FHY3和FAR1在phyA的信号传导中的部分重叠作用
• 3 FHY3不同结构域的功能研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 植物品种
• 3.2.2 菌株
• 3.2.2.1 大肠杆菌
• 3.2.2.2 农杆菌
• 3.2.2.3 酵母菌（Yeast）
• 3.2.3 质粒载体
• 3.2.4 试剂盒及酶
• 3.2.5 其他各类化合物
• 3.3 方法
• 3.3.1 载体构建
• 3.3.1.1 载体构建方法
• 3.3.1.2 载体具体构建步骤
• 3.3.2 点突变
• 3.3.3 大肠杆菌转化
• 3.3.4 农杆菌转化
• 3.3.5 酵母杂交
• 3.3.5.1 酵母单杂交
• 3.3.5.2 酵母双杂交
• 3.3.5.3 β-半乳糖苷酶（β-galactocidase）的测定
• 3.3.6 拟南芥基因组DNA提取
• 3.3.7 拟南芥总RNA的提取
• 3.3.8 PCR反应
• 3.3.9 RT-PCR检测
• 3.3.10 酵母蛋白质的提取
• 3.3.11 免疫印迹实验（Immunoblot assay）
• 3.3.12 电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA）
• 3.3.13 拟南芥原生质体转化
• 3.3.13.1 质粒DNA的提取
• 3.3.13.2 拟南芥原生质体的分离
• 3.3.13.3 PEG转化
• 3.3.13.4 LUC和GUS的测定
• 3.3.14 叶绿素和花青素的测定
• 3.3.14.1 叶绿素的测定
• 3.3.14.2 花青素的测定
• 3.3.15 Confocal显微镜观察
• 3.3.16 拟南芥种植
• 3.3.17 拟南芥转化
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 FHY3氮末端C2H2型锌指结构域的DNA结合功能
• 3.4.1.1 酵母体系中FHY3的DNA结合活性验证
• 3.4.1.2 EMSA实验中FHY3的DNA结合活性验证
• 3.4.1.3 拟南芥转基因植株中FHY3的DNA结合活性验证
• 3.4.2 FHY3转座酶催化结构域和SWIM模体的转录激活活性
• 3.4.2.1 酵母体系中FHY3转录激活活性验证
• 3.4.2.2 拟南芥原生质体中FHY3转录激活活性验证
• 3.4.2.3 拟南芥转基因植株中FHY3转录激活活性验证
• 3.4.3 FHY3的转录激活活性与其二聚体形成
• 3.4.4 FHY3的细胞核定位
• 4 讨论
• 4.1 FHY3和FAR1的部分重叠功能
• 4.2 FHY3不同结构域的功能分析
• 5 结论与展望
• 参考文献
• 附录1 各类化合物
• 附录2 PCR引物
• 附录3 氨基酸及碱基
• 作者简历
• 攻读博士学位期间发表论文