家蚕BmCH基因的原核表达和亚细胞定位研究

论文摘要

从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选得到一条cDNA序列,经生物信息学分析发现其含有一个CHCH保守结构域,将其命名为BmCH （Genbank登录号为:ABF51514.1）。该序列的开放阅读框大小为435 bp,编码144个氨基酸残基,预测编码蛋白的分子量大小为14.82 kDa,等电点为8.549。根据cDNA序列的ORF设计了上下游引物,PCR扩增后经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,插入融合表达载体pET-28a（+）的相应酶切位点,成功构建重组质粒pET-28a- BmCH,转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞,经PCR、酶切鉴定后证实重组正确。用IPTG诱导后裂解菌液经SDS-PAGE分析,约在20 kDa处有一特异性蛋白条带,超声破碎重组菌后发现融合蛋白主要以包涵体的形式存在,通过亲和层析纯化获得较纯的融合蛋白。将该蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。ELISA检测该抗体的效价达1:12800。通过Western blot和荧光定量PCR的方法检测BmCH蛋白在家蚕四个发育时期和五龄幼虫多个组织中的转录水平和表达情况,发现该蛋白在卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个发育时期均有表达,其中五龄幼虫中表达量最高;该蛋白在五龄幼虫的表皮、睾丸、肠、马氏管和卵巢中有明显表达,血、丝腺、脂肪表达量较少,但差异不大,气管和头中没有表达。和荧光定量PCR检测结果基本一致。利用抗体的免疫荧光标记对BmCH蛋白在家蚕BmN细胞中的定位进行研究,观察到荧光主要集中在细胞质中。本研究结果为进一步研究家蚕BmCH蛋白的结构和功能奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 前言
• 1 CHCH 结构域的发现
• 2 CHCH 蛋白家族的结构特征
• 2.1 S 亚群
• 2.2 N 亚群
• 2.3 C 亚群
• 3 CHCH 相关蛋白的生物学功能
• 3.1 酵母中CHCH 相关蛋白
• 3.2 人类中CHCH 相关蛋白
• 3.3 小鼠中CHCH 相关蛋白
• 3.4 果蝇和秀丽隐杆线虫中CHCH 相关蛋白
• 4 展望
• 第二章 实验方案设计
• 1 实验目的和意义
• 2 研究内容
• 3 试验流程图
• 第三章 生物信息学分析
• 1 材料与工具
• 1.1 材料
• 1.2 生物信息学工具
• 2 方法及结果
• 2.1 基因的基本信息
• 2.2 疏水性分析
• 2.3 跨膜分析
• 2.4 信号肽分析
• 2.5 亚细胞定位分析
• 2.6 蛋白质的功能位点预测
• 2.7 蛋白质的同源性比较
• 3 讨论
• 第四章 家蚕BmCH 基因的克隆与表达
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 试验方法
• 2.1 重组表达质粒的构建
• 2.1.1 PCR 扩增目的片段
• 2.1.2 PCR 产物试剂盒回收
• 2.1.3 PCR 产物与表达载体pET-28a 的双酶切
• 2.1.4 胶回收酶切产物
• 2.1.5 连接反应
• 2.1.6 E.coli TG1、Rosetta 感受态细胞的制备
• 2.1.7 连接产物的转化
• 2.1.8 重组克隆的筛选与鉴定
• 2.1.8.1 挑斑及质粒抽提
• 2.1.8.2 PCR 鉴定
• 2.1.8.3 双酶切鉴定
• 2.2 BmCH 基因的表达
• 2.2.1 转化Rosetta 表达菌株
• 2.2.2 挑斑、PCR 鉴定及双酶切鉴定
• 2.2.3 重组质粒在大肠杆菌中的表达
• 2.2.4 SDS-PAGE 电泳分析
• 2.2.4.1 制胶
• 2.2.4.2 样品处理
• 2.2.4.3 上样
• 2.2.4.4 电泳
• 2.2.4.5 考马斯亮蓝染色与脱色
• 3 结果
• 3.1 PCR 扩增目的片段
• 3.2 重组质粒的双酶切鉴定和PCR 扩增
• 3.3 融合蛋白的诱导表达
• 4 讨论
• 第五章 融合蛋白的纯化及多克隆抗体的制备
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料与设备
• 1.2 试剂
• 1.2.1 His 亲和层析纯化试剂
• 1.2.2 Bradford 蛋白定量用试剂
• 1.2.3 抗体制备用试剂
• 1.2.4 ELISA 用试剂
• 1.2.5 Western blot 试剂
• 2 方法
• 2.1 融合蛋白的纯化
• 2.1.1 包涵体的溶解以及样品的制备
• 2.1.2 镍柱纯化融合蛋白
• 2.1.3 Bradford 法检测蛋白浓度
• 2.2 多克隆抗体的制备
• 2.2.1 抗原的制备
• 2.2.2 免疫新西兰兔
• 2.2.3 多克隆抗血清的制备
• 2.2.4 抗体的效价测定
• 2.2.5 抗体特异性检测
• 3 结果
• 3.1 融合蛋白的纯化结果
• 3.2 抗体的效价测定
• 3.3 Western blot 检测抗体的特异性
• 4 讨论
• 第六章 BmCH 蛋白在家蚕中的表达分析
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 总RNA 的提取
• 2.2 DNA 酶消化
• 2.3 逆转录成cDNA
• 2.4 荧光定量PCR 引物的设计
• 2.5 荧光定量PCR
• 2.6 荧光定量PCR 数据分析
• 2.7 蛋白质的抽提
• 2.8 Western blot 检测蛋白的分布
• 3 结果
• 3.1 家蚕发育过程中BmCH mRNA 转录水平分析
• 3.2 家蚕发育过程中BmCH 蛋白表达量的比较
• 3.3 五龄幼虫各组织中BmCH mRNA 转录水平分析
• 3.4 五龄幼虫各组织中BmCH 蛋白表达量的比较
• 4 讨论
• 第七章 BmCH 的亚细胞定位
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂配制
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢