猪胰腺干细胞分离鉴定

论文摘要

糖尿病是全球性医学难题,目前,对糖尿病的治疗虽然有很多方法,但都不能从根本上解决问题。主要受制于供体不足和免疫排斥的问题。因此,人们寄希望于干细胞替代疗法。干细胞增殖力强、数量充足、移植排斥反应相对较低,更重要的是胰腺干细胞可塑性强,可以分化形成胰腺组织的各种细胞。猪胰腺干细胞的研究,目的在于解决干细胞来源的问题.本人在实验室以往的工作基础上,进一步分离、鉴定猪胰腺干细胞。无菌采集胎猪胰腺120例,采用酶消化法,用RPMI1640加入1mmol/L丙酮酸钠,71.5μmol/Lβ-巯基乙醇,20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF,100U/mL青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL,添加10% FBS作培养基培养细胞。结果有59例仅获得原代细胞,部分传至6～8代后,细胞大量飘浮死亡。同时观察到细胞传至6～8代时,随着细胞的大量死亡漂浮,皿底始终零散地保留一些圆形的、折光性强的小细胞。此时采用含20%血清的上述培养液后,皿中的小细胞在换液24h后形态发生变化,变大、变长,迅速扩增。48h后,每个小圆细胞形成一个克隆,96h后形成大的克隆,直径超过100um,随后细胞不断从集落边缘迁徙出来,细胞间相互连接,形成网络状生长,5～6天就会融汇成单层,此类细胞可以多次进行传代。由此发现胰腺干细胞不能传过7～8代的制约因素,成功地突破了胰腺干细胞扩增难题,并且一次获得4株胰腺干细胞,其中一株已经顺利传至64代,另3例传至10代,各代均有冻存;在诱导分化实验中观察到如果用无血清的培养基诱导胰腺干细胞向β细胞分化,细胞可以大量形成胰岛细胞团,但是成团后细胞活力很快下降,发黑、漂浮甚至死亡。因此,进一步探索了诱导条件,采用含血清的诱导液诱导,不仅可以促使胰腺干细胞向胰岛内分泌细胞分化,而且有效地避免了细胞分化后活力下降的问题。利用高糖刺激胰岛素释放实验,胰岛素和c-肽的分泌量分别可以达到306.87±20.72 mIU/mL和0.31±0.11ng/mL。经免疫组化检测,细胞表达目前公认的胰腺干细胞特异性标记物,如胰肠同源域因子1、葡萄糖转运子2、巢蛋白和波形蛋白,经RT-PCR检测,细胞表达胰肠同源域因子1、葡萄糖转运子2、胰淀素前体、胰岛素、生长抑素,确定分离获得的细胞为胰腺干细胞。细胞经成骨细胞诱导液诱导后,有明显的细胞聚集成团块状物的形成,经茜素红染色呈阳性;向神经细胞诱导后,细胞NF-200染色阳性;细胞亦表达胚胎干细胞的一些标志,如强表达胚胎干细胞的表面标志物OCT-4、胚胎阶段特异性抗原（1Stage-specific embryonic antigens SSEA-1）;用流式细胞仪证实细胞表达骨髓间充质干细胞的一些表面标志,如CD29,CD44,CD166。通过裸鼠致瘤性实验证实所分离的胰腺干细胞无致瘤性。并制备了大鼠糖尿病模型,将诱导后的细胞经腹腔注射给大鼠模型用于治疗,仅在注射后的2～4天内,血糖略有下降。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 干细胞与胰腺干细胞
• 1.1 干细胞的分类
• 1.2 胰腺干细胞的概念
• 1.3 胰腺干细胞存在的证据
• 1.4 胰腺干细胞存在的部位
• 1.5 国外胰腺干细胞研究进展
• 1.5.1 支持胰腺干细胞存在于胰导管的研究
• 1.5.2 支持胰腺干细胞存在于胰岛的研究
• 1.5.3 支持胰腺干细胞源于胰腺细胞转分化的研究
• 1.6 国内胰腺干细胞研究进展
• 1.6.1 支持胰腺干细胞存在于胰导管的研究
• 1.6.2 支持胰腺干细胞存在于胰岛的研究
• 1.7 胰腺干细胞的鉴定
• 1.7.1 胰肠同源域因子1
• 1.7.2 神经原素3
• 1.7.3 Nestin
• 1.7.4 酪氨酸羟化酶
• 1.7.5 其他
• 1.8 胰腺干细胞的来源
• 第二章 干细胞与治疗糖尿病
• 2.1 糖尿病治疗的历史与现状
• 2.1.1 胰腺器官移植
• 2.1.2 胰岛细胞移植
• 2.2 干细胞治疗糖尿病
• 2.2.1 成体干细胞
• 2.2.2 胚胎干细胞
• 2.2.3 异种干细胞
• 2.2.4 基因工程细胞
• 2.3 胰腺干细胞临床应用前景
• 第三章 猪胰腺干细胞研究进展
• 3.1 猪胰腺干细胞替代人胰腺干细胞的可行性
• 3.1.1 猪胰岛素与人类胰岛素结构
• 3.1.2 猪与人类胰岛素分泌血糖调定点
• 3.2 猪胰腺干细胞研究进展
• 3.2.1 材料选取
• 3.2.2 胰腺干细胞类型及存在部位
• 3.3 细胞分离方法与纯化
• 3.3.1 胰腺灌注酶法
• 3.3.2 胶原酶直接消化法
• 3.4 培养及扩增体系
• 3.4.1 共同的添加物质
• 3.4.2 培养基及培养方法
• 3.5 猪胰腺干细胞的诱导分化
• 3.6 猪胰腺干细胞研究中存在问题及解决办法
• 3.6.1 干细胞扩增
• 3.6.2 免疫排斥与解决办法
• 3.6.3 种间交叉感染
• 3.6.4 胰腺干细胞治疗时的数量问题
• 3.7 小结
• 第四章 胰腺干细胞的分离、扩增及诱导
• 4.1 胰腺干细胞的分离
• 4.1.1 胰腺结构
• 4.1.2 消化酶
• 4.1.3 细胞纯化
• 4.2 常用的培养基
• 4.3 培养基添加物
• 4.3.1 EGF
• 4.3.2 bFGF
• 4.3.3 血清
• 4.4 诱导方法及诱导添加物
• 4.4.1 定向诱导的方法
• 4.4.2 常用的诱导因子
• 4.5 小结
• 实验研究
• 第五章 胎猪胰腺干细胞扩增方法的建立
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验动物
• 5.1.2 主要仪器及试剂
• 5.1.3 主要溶液的配制
• 5.1.4 细胞分离与传代
• 5.1.5 细胞免疫组化染色
• 5.1.6 分子生物学鉴定
• 5.2 结果
• 5.2.1 胰腺干细胞细胞生长行为
• 5.2.2 细胞免疫组化染色
• 5.2.3 分子生物学检测
• 5.3 讨论
• 第六章 猪胰腺干细胞生物学特性的研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验动物
• 6.1.2 主要试剂、仪器
• 6.1.3 方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 细胞生长形态
• 6.2.2 向胰岛细胞诱导结果
• 6.2.3 胚胎干细胞标志的检测结果
• 6.2.4 向成骨细胞、神经细胞诱导结果
• 6.2.5 生长曲线的测定结果
• 6.2.6 胰腺干细胞致瘤性实验结果
• 6.2.7 流式细胞仪检测结果
• 6.2.8 制备大鼠糖尿病模型与胰岛细胞移植
• 6.3 讨论
• 结论
• 创新点
• 下一步工作设想
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介