高Cx/FPA酶菌株的选育及产酶特性研究

论文摘要

水洗纤维素酶组分不平衡,具有高Cx 酶活,低FPA 酶活的特性,应用于纺织品后整理时,可使棉针织物表面部分水解。处理适当可使整理后的针织物有精细的外观和手感,织物变得光洁柔软,服装穿着舒适、自然,且具有污染少的优点。但我国水洗纤维素酶仍然存在着酶产量及酶比活力低、发酵优化条件不清楚,难实现大规模生产、水洗效果重演性差等问题。因此,选育高产菌株,探索发酵条件,对其所产纤维素酶特征有一定的研究和掌握,有着非常重要的意义。本文以一株具有高Cx/FPA 酶生产菌的M 菌株出发,通过多种诱变方法选育出一株高产菌株M-18,Cx 酶比活力提高2.56 倍,达398.00U/ml,而其FPA酶活力提高不多。进行发酵优化试验,确定了合适的碳源、氮源以及发酵条件:以2%的甜高粱渣为碳源,以0.2% NaNO3为氮源,其余蛋白胨0.3%,酵母膏0.05%,K2HPO40.4%,CaCl20.03%,MgSO4 0.03%,CMC-Na 1%,50 ml/瓶装液,30℃,180r/min 摇瓶培养5d。经优化后Cx 酶比活力比优化前提高90.55U/ml。间歇补料流加实验表明:在M-18 发酵过程中流加复合氮源（蛋白胨1%,1.0 ml/瓶+牛肉浸出膏1%,0.6 ml/瓶）;KH2PO4 1%,1.0ml/瓶;CMC-Na0.5%,1.0 ml/瓶能够进一步提高M-18 产酶水平,使Cx 酶比活力提高了78.95U/ml。研究M-18 Cx 酶的作用条件,结果表明酶促反应最适条件为:温度50℃,pH 值4.6。当底物浓度远远大于酶浓度时,酶促反应速度与底物浓度成正比,应以不同的效果要求来选择酶浓度。对牛仔布进行整理时,处理时间要30min以上。酶促反应时添加微量的Zn2+、Fe2+、Cu2+有促进作用。对Cx 酶进行分离纯化,得到纯的Cx 酶,分子量56.85 KD。以M-18 菌种的发酵液处理牛仔布,可使布样柔软,表面光滑。该菌种在纺织品后整理中将有一定的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1 纤维素酶概述
• 1.1 纤维素酶的组成
• 1.2 纤维素酶的来源
• 1.3 纤维素酶的水解机理
• 1.3.1 纤维素酶的作用机制
• 1.3.2 纺织用纤维素酶的作用机理
• 1.4 纤维素酶的诱导调控机理
• 1.5 纤维素酶活力的测定方法
• 1.6 纤维素酶的理化性质
• 2 纤维素酶的生产
• 2.1 菌株选育
• 2.2 固体发酵
• 2.3 液体发酵
• 3 纤维素酶在纺织物整理中的应用研究进展
• 3.1 纤维素酶在棉麻织物整理方面的应用
• 3.1.1 麻织物的后整理
• 3.1.2 棉麻织物的生物后整理
• 3.1.3 纤维素酶对棉麻织物的作用机理
• 3.1.4 纤维素酶在织物后整理中的效果
• 3.1.5 纤维素酶生物整理的优点
• 3.2 纤维素酶在牛仔服生物后整理中的应用
• 3.2.1 牛仔服生物后整理的应用进展
• 3.2.2 纤维素酶用于牛仔布后整理上的应用进展
• 4 影响纤维素酶应用纺织品后整理的因素[]
• 4.1 纤维素酶的用量
• 4.2 处理液的pH 值
• 4.3 处理液的温度
• 4.4 处理时间
• 5 纤维素酶应用中的问题与今后研究方向
• 第二部分 研究论文
• 1 引言
• 2 材料、试剂及仪器
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.2 试剂及常用缓冲液配制
• 2.3 仪器
• 3. 实验方法
• 3.1 菌种培养及产酶方法
• 3.2 酶活力测定方法
• 3.2.1 测定原理
• 3.2.2 葡萄糖标准曲线绘制
• 3.2.3 测定方法
• 3.3 蛋白质浓度测定方法
• 3.3.1 测定原理及方法
• 3.3.2 牛血清蛋白标准曲线绘制
• 3.4 M 菌株的菌落观察及形态初步鉴定方法
• 3.5 M 菌株的诱变选育
• 3.5.1 孢子悬液制备
• 3.5.2 紫外诱变
• 3.5.3 亚硝基胍（NTG）处理
• 3.5.4 紫外与NTG 复合处理
• 3.5.5 高Cx /FPA 酶菌株的初筛方法
• 3.5.6 高Cx 酶/FPA 菌株的复筛方法
• 3.6 粗酶液制备
• 3.7 sephadex G-75 凝胶层析
• 3.8 SDS-PAGE 电泳
• 3.9 M-18 的发酵优化试验方案
• 3.10 O-18 发酵过程补料流加试验方案
• 3.11 工厂应用检验方案
• 4. 结果与讨论
• 4.1 M 菌株的菌落特征及形态初步鉴定
• 4.2 M 菌株酶系组成
• 4.3 M 菌株的诱变选育结果
• 4.3.1 紫外诱变结果
• 4.3.2 NTG 处理结果
• 4.3.3 复合诱变结果
• 4.3.4 正突变菌株的复筛
• 4.3.5 M-18 菌株的传代稳定性
• 4.4 M-18 液体发酵优化条件
• 4.5 间歇式补料流加促进M-18 产酶
• 4.6 M-18 产Cx 酶作用条件的研究
• 4.6.1 最适作用温度及热稳定性
• 4.6.2 最适pH 及pH 稳定性
• 4.6.3 酶液浓度对Cx 酶反应速度的影响
• 4.6.4 反应时间对酶活力的影响
• 4.6.5 金属离子对M-18 Cx 酶活的影响
• 4.7 应用结果
• 4.8 Cx 酶的分离纯化
• 4.8.1 Cx 酶的分离纯化结果
• 4.8.2 分子量测定
• 5 小结与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 声 明