P2X7受体在雌激素促进乳腺癌细胞系MCF-7增殖中的作用

论文摘要

雌激素是一种作用广泛的类固醇类激素,对生殖系统、乳腺、骨骼及心血管系统生长发育功能有调节作用。雌激素的活性失调可导致相关性肿瘤及疾病的发生。已有研究显示,雌激素受体在诸多肿瘤组织和细胞株中均有表达,如生殖系统肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、消化系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、头颈部肿瘤、血液系统肿瘤等。乳腺癌被认为是女性最常见的恶性肿瘤之一。近年来研究发现,内源性雌激素水平持续增高或外源性补充雌激素均可使乳腺癌发病率明显增加。体外研究也表明雌激素促进乳腺细胞的转化和雌激素受体阳性乳腺肿瘤细胞的增殖与侵袭。雌激素主要是通过与雌激素受体（estrogen receptor, ER）结合起来发挥作用。ER有两种作用模式,经典的作用模式是雌激素与雌激素受体结合,通过靶基因上游的雌激素反应元件（estrogen reactive element, ERE）调控靶基因的转录,这种机制被称为雌激素的基因组作用模式（或称核启动的雌激素应答）,需要雌激素与ER形成复合体后转移至细胞核才能发挥作用,同时ER还可以通过招募共激活因子的途径与其他一些调控细胞增殖的转录因子,如AP-1和c-Jun等相互作用激活一些基因的转录。雌激素还存在非基因组作用模式（或称膜启动的雌激素应答）,通过分布于细胞膜的雌激素结合蛋白,激活细胞内信号,从而改变胞内蛋白功能和调控基因表达。目前已发现的与人类相关的雌激素受体亚型为ERα和ERβ两种亚型。而由于ERα和ERβ两种亚型配体结合区氨基酸系列同源性只为55%,该配体结合区氨基酸系列差异是ERα和ERβ两种亚型各自具有独物特转录作用的关键。使得ERα和ERβ具有不同的调节基因转录活性,最终发挥不同的临床作用。ERα主要是作为基因转录的激动剂,而ERβ主要是作为基因转录的抑制剂。在ER亚型的表达对乳腺癌的预后的研究中,ERα与预后呈正相关是被普遍认可的,研究认为ERα水平上调,促进肿瘤坏死因子（TGF）-α表达,从而促进肿瘤发生。而在子宫内膜癌的发生发展中,ERα、ERβ两者在其发展过程中作用相反。ATP不仅是一种贮能、供能物质,还是一种细胞间信息传递物质,通过激活P2X（配基门控性非选择性阳离子通道,7个亚型）和P2Y（G一蛋白耦联,8个亚型）受体而产生广泛的生物学效应。P2X7受体因其独特的结构和功能,是近年研究的热点。其受体广泛表达在多种组织,生理功能呈多样性。包括过氧化物和NO的生成,T细胞的激活和成熟,诱导细胞产生炎症细胞因子,诱导淋巴细胞形成膜泡等。P2X7受体的异常表达与肿瘤、炎症等相关。大量的研究发现,P2X7受体广泛表达在上皮性肿瘤组织或细胞中：1)肿瘤组织或细胞中的表达明显高于对应正常组织或细胞,如甲状腺癌、前列腺癌等；2)肿瘤组织或细胞中的表达明显低于对应正常组织或细胞,如外胚层来源的皮肤、泌尿生殖窦的膀胱及宫颈阴道部以及苗勒管来源的内宫颈和子宫内膜部。2002年,Carley等对大鼠膀胱中P2X受体的研究结果显示：去卵巢大鼠膀胱中P2X3受体表达明显增加。本实验室前期的研究发现,在结直肠至炎情况下,雌激素促进大鼠背根神经节P2X3 mRNA的表达,而下调P2Y1 mRNA的表达。提示雌激素可能对ATP受体的表达和功能有调节作用。因而我们推测在雌激素依赖的肿瘤细胞中,雌激素可能也对ATP受体的表达有调节作用,从而来影响细胞的生长分化、增殖凋亡。但迄今为止,这方面的研究国内外尚未见报道。已有研究发现,基于以上的推测,我们想通过对雌激素依赖性肿瘤细胞中ATP受体的研究,以及雌激素对ATP受体及细胞内信号转导的调节作用,将为阐明雌激素对恶性肿瘤的发生及发展的作用提供新的线索；为研制新一代的抗肿瘤药物提供实验依据。目前仅有乳腺癌的ER研究较为深入,对于乳腺癌,雌激素受体是它的生物学标志物,是目前比较可靠的指导治疗和判定乳腺癌预后的重要指标。同时已有的研究发现：1)乳腺癌细胞MCF-7本身可以分泌ATP,2)外源性ATP可以抑制乳腺癌肿瘤细胞的生长。故本实验先以ER（+）乳腺癌细胞MCF-7为模型,观察细胞上P2X7受体的表达和对细胞的生长的作用,以及雌激素可能通过对P2X7受体表达的调节功能从而来影响细胞的生长分化、增殖凋亡。以雌激素与ATP受体的相互关系的基础研究为前提,为我们后续进行激素依赖性肿瘤（如子宫内膜癌、卵巢癌）的研究提供理论基础,和为更好地开展临床治疗和评估预后提供对策及抗肿瘤新药研发提供合理的靶向。第一部分乳腺癌中P2X7受体的表达目的：研究乳腺癌中P2X7受体的表达与ER受体的相关性。方法：为了明确乳腺癌中P2X7受体表达与雌激素受体的相关性,我们对临床收集的乳腺癌石蜡切片标本包括乳腺浸润性导管癌及癌旁正常组织（乳腺癌又分ER阳性,ER阴性）共64例进行了P2X7受体的免疫组化检测。结果：1)正常乳腺组织中P2X7受体几乎是不表达的；2)64例乳腺浸润性导管癌中,28例ER表达阳性；38例P2X7受体阳性,ER阳性者有22例。经统计学分析,P2X7受体表达与雌激素受体有相关性,有统计学意义（P<0.01）。结论：乳腺导管癌中P2X7受体的表达与雌激素受体ER的表达,呈正相关性。第二部分乳腺癌细胞MCF-7中P2X7受体的表达以及其与雌激素对细胞增殖的影响目的：乳腺癌细胞MCF-7中P2X7受体的表达；雌激素和P2X7受体对MCF-7细胞增殖的影响。方法：1.琼脂糖凝胶电泳2. MTT法雌激素及拮抗剂ICl182 780,雌激素选择性拮抗剂[雌激素ERQ拮抗剂（MPP,5×10-5mol/L）,雌激素ERβ拮抗剂（PHTPP,5×10-5mol/L）],P2X7受体激动剂（BzATP）及拮抗剂（PPADS）,雌激素处理后P2X7受体拮抗剂对对MCF-7细胞增殖的影响。结果：1 ER（+）乳腺癌细胞MCF-7中表达P2X7受体,大小约399bp。2雌激素和P2X7受体对MCF-7细胞增殖的影响1)雌激素及拮抗剂对细胞增殖的影响激素依赖性的人乳腺癌MCF-7细胞在不同浓度E2作用下,呈现不同的生长反应,即E2在1×10-10mol/L时开始刺激细胞生长,在1×10-8mol/L时刺激作用达高峰,之后随E2浓度的升高,其刺激作用逐渐减弱,各组与对照组之间比较差异均有统计学意义（P<0.01）。E2拮抗剂ICll82780抑制了雌激素对MCF-7细胞株的促增殖作用,与雌激素组（1×10-7nol/L）比较有显著差异（P<0.01）。2)雌激素选择性拮抗剂对细胞增殖的影响雌激素ERα拮抗剂（MPP）,雌激素ERβ拮抗剂（PHTPP）本身对细胞的增殖无明显作用,与对照组无统计学意义；但是E2（1×10-7mol/L）联合ERα雌激素拮抗剂（MPP）组对细胞的增殖有明显减弱,与单独加雌激素组比较差异有统计学意义（P<0.01）。而E2（1×10-7mol/L）联合雌激素ERβ拮抗剂（PHTPP）组对细胞有促增殖作用,与单独加雌激素组比较无统计学意义,与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。3)P2X7受体激动剂和拮抗剂对细胞增殖的影响BzATP（1×10-4mol/L）组与对照组之间比较差异有统计学意义（P<0.01）,对MCF-7细胞株的的生长有促增殖效应；PPADS（1×10-6mol/L）本身对细胞的增殖无明显作用,与对照组无统计学意义；但是BzATP联合PPADS组与单独加BzATP组比较差异有统计学意义（P<0.01）,对BzATP诱导的细胞增殖有抑制效应。4)P2X7受体在雌激素及拮抗剂处理后对细胞活性的影响E2在1×10-7mol/L与对照组之间比较差异有统计学意义（P<0.01）,对MCF-7细胞株的生长有促增殖效应；PPADS在1×10-6mol/L本身对细胞的增殖无明显作用,与对照组无统计学意义；E2（1×10-7mol/L）联合PPADS组对细胞的增殖有减弱,与单独加雌激素组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：雌激素通过雌激素受体ERα对MCF-7细胞的生长有促增殖作用；P2X7受体对MCF-7细胞也有促增殖作用。第三部分雌激素对乳腺癌细胞MCF-7中P2X7受体mRNA和蛋白表达的影响目的：研究雌激素对P2X7受体mRNA和蛋白表达的调控作用方法：实时定量PCR和免疫印迹法检测雌激素及拮抗剂ICll82 780,雌激素选择性拮抗剂[雌激素ERα拮抗剂（MPP）,雌激素ERβ拮抗剂（PHTPP）]处理后,P2X7受体mRNA和蛋白的表达结果：1)雌激素及拮抗剂对P2X7受体的mRNA及蛋白表达的影响经4个不同浓度（10-10、10-9、10-8、10-7mol/L）的E2作用后,与对照组相比,各实验组MCF-7细胞中P2X7受体mRNA和蛋白的表达随着雌激素的浓度增加呈递增的趋势,E2在1×10-9mol/L,1×10-8nol/L,1×10-7mol/L与对照组之间比较有显著性差异,有统计学意义（P<0.01）,1×10-10mol/L雌激素组与对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。E2拮抗剂ICl182 780可以抑制雌激素对MCF-7细胞株中P2X7受体mRNA和蛋白表达的上调作用,与雌激素组（1×10-7mol/L）比较有显著统计学意义（P<0.01）。提示雌激素对ER（+）人乳腺癌细胞MCF-7中P2X7受体的表达有上调作用,且有浓度依赖性,雌激素拮抗剂ICI可以阻断这种效应。2)雌激素选择性拮抗剂对P2X7受体的mRNA及蛋白表达的影响雌激素ERα拮抗剂（MPP）,雌激素ERβ拮抗剂（PHTPP）本身对P2X7受体的mRNA及蛋白的表达的调控无明显作用,与对照组无统计学意义；但是E2（1×10-7mol/L）联合雌激素雌激素ERα拮抗剂（MPP）组中P2X7受体的mRNA及蛋白的表达有明显减弱,与单独加雌激素组比较差异,有统计学意义（P<0.01）。而E2（1×10-7mol/L）联合雌激素ERβ拮抗剂（PHTPP）组中P2X7受体的mRNA及蛋白的表达是上调的,与单独加雌激素组比较无统计学意义,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：雌激素可能通过调控P2X7受体的表达来完成对ER（+）人乳腺癌细胞MCF-7的促增殖效应,且具有浓度依赖性；而这种效应是通过受体ERα完成的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略语注释
• 前言
• 实验材料及试剂
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 致谢