具细胞毒活性海洋微生物的分离筛选及次级代谢物的研究

论文题目: 具细胞毒活性海洋微生物的分离筛选及次级代谢物的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 胡申才

导师: 喻子牛,洪葵,谭仁祥

关键词: 海洋微生物,细胞毒,次级代谢物,分离鉴定,异黄酮

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 号称第二号“杀手”的肿瘤疾病严重威胁着人类的生命健康,对其仍无医治良方。在治疗癌症方面,天然来源药物发挥着重要的延年益寿作用。自20世纪40年代从一株点青霉（Penicillium notatum）中发现青霉素后,陆地微生物,尤其是链霉菌属,因它们能产生丰富的且具有一定生物活性作用的次级代谢物而受到广泛关注。经过几十年的大量开发,从陆地微生物中开发到新型次级代谢产物的几率已大为降低,因此科学家们将目光投向了占陆地表面积达70%以上的海洋环境,期待从中能开发到具新型结构的化合物。生活在海洋环境当中的海洋微生物种类繁多,且因生存环境独特（高压、高盐和高温等）而能够产生结构新颖、功能独特的次级代谢物。因此,本论文开展了从海洋微生物次级代谢产物中筛选具细胞毒作用的先导化合物的研究工作。 本文对从海南岛近海区采集的59个样品,通过采用IM、GS、SC、GA、M1、YE、GIN、HV、CZ和MT等10种分离培养基和加热、SDS、苯酚、几丁质富集和YE富集等5种预处理方法,共分离到1409株海洋微生物菌株,其中细菌962株,丝状真菌168株,放线菌279株。同时发现,采用加热和SDS等2种预处理方法和GS、SC和YE等3种培养基有利于放线菌的分离。 本研究对MTT法和稻瘟霉孢子法这两种筛选模型对海洋微生物细胞毒活性菌株筛选的相关性进行了比较,以确定出稻瘟霉孢子法能否作为本实验室的细胞毒药物快速筛选方法。结果表明,当采用稻瘟霉孢子法作初筛时,假阳性率可达26.26%,且会漏筛掉一半以上的细胞毒活性菌株,因此不适合作为细胞毒活性菌株的初筛模型。采用MTT法对筛选分离得到的1409株海洋微生物菌株的发酵液进行了初步筛选后共获得208株活性菌株,其中细菌的阳性率为12.75%,放线菌为22.10%,真菌为14.29%。 在本研究中对分离获得的对白血病细胞系K562具强细胞毒活性(ID50>1000)的3株链霉菌050642、060386和060524等菌株进行了生理生化性状的初步研究,结果表明3株菌遗传稳定性好,均有一定的开发价值。 利用硅胶柱层析、反相C18柱层析和Sephadex LH-20等层析分离手段,通过活性跟踪法对具强细胞毒活性的链霉菌菌株060524的次级代谢物进行了分离,同时利用质谱（ESI-MS或EI-MS）、核磁共振(1H NMR、13C-NMR、DEPT和

论文目录:

摘要

ABSTRACT

缩略语

第一章 文献综述

1.1 海洋微生物资源的分布及其种类

1.1.1 海洋微生物的栖息地及其多样性

1.1.1.1 病毒

1.1.1.2 细菌

1.2 海洋微生物代谢产生的活性物质

1.2.2 影响海洋微生物生物活性物质产生的因素

1.2.2.1 温度

1.2.2.2 海水

1.2.2.3 培养基

1.2.2.4 混合培养

1.2.3 海洋微生物次级代谢物及其生物活性

1.2.3.1 生物碱类

1.2.3.2 环肽类

1.2.3.3 大环内酯类化合物

1.2.3.4 含硫和含卤化合物

1.2.3.5 萜类

1.2.3.6 反式十氢萘聚酮类

1.2.3.7 香豆素类和异香豆素化合物

1.2.3.8 醌类化合物

1.2.3.9 聚醚类化合物

1.2.3.10 其它化合物

1.3 研究目的与意义

第二章 海洋微生物菌株的分离培养

2.1 材料和方法

2.1.1 材料

2.1.1.1 培养基

2.1.1.2 分离海洋微生物菌株的样品来源

2.1.1.3 仪器

2.1.2 方法

2.1.2.1 溶液的配制

2.1.2.2 样品的采集

2.1.2.3 样品粗处理

2.1.2.4 几丁质富集培养基制备

2.1.2.5 菌株分离前的预处理

2.1.2.6 菌株分离培养中抑制剂的添加

2.1.2.7 稀释涂布与分离

2.1.2.8 海洋微生物菌株的分离与纯化

2.1.2.9 菌种保藏和保藏编号

2.1.2.10 菌株的发酵培养

2.1.2.11 菌种发酵上清液的收集

2.1.2.12 样品分批次进行菌株分离

2.2 结果与分析

2.2.1 第四批样品菌株分离结果

2.2.2 第五批样品菌株分离结果

2.2.3 第6批样品菌株分离结果

2.3 小结与讨论

第三章 抗肿瘤活性菌株的筛选分离

第一节 抗肿瘤药物体外快速活性筛选系统的确定

3.1.1 MTT法细胞毒活性测定

3.1.1.1 材料

3.1.1.2 方法

3.1.2 稻瘟霉孢子活性测定

3.1.2.1 材料

3.1.2.2 方法

3.1.2 结果与分析

3.1.2.1 MTT法筛选海洋微生物细胞毒活性菌株

3.1.2.2 抗稻瘟霉孢子法筛选海洋微生物活性菌株

3.1.2.3 MTT法与稻瘟霉孢子法对发酵液活性菌株筛选结果比较

3.1.3 讨论

第二节 海洋微生物细胞毒活性菌株的筛选

3.2.2 方法

3.2.2.1 初筛待测样品的制备

3.2.2.2 MTT法细胞毒活性菌株的筛选

3.2.2.3 第一和第二次复筛

3.2.2.4 第三次复筛

3.2.2.5 高活性菌株对K562、B16、Tca8113和SMMC7721等细胞系的细胞毒性的测定

3.2.3 结果与分析

3.2.3.1 初筛结果

3.2.3.2 不同样品类型对活性菌株比率的统计分析

3.2.3.3 不同预处理对活性菌株比率的统计分析

3.2.3.4 不同分离培养基对活性菌株比率的统计分析

3.2.3.5 不同微生物种类对活性菌株比率的统计分析

3.2.3.6 第一次复筛

3.2.3.7 第二次复筛

3.2.3.8 第三次复筛

3.2.3.9 高活性菌株对K562、B16、Tca8113和SMMC7721等细胞系的细胞毒性的测定

3.2.4 小结与讨论

第四章 具强细胞毒活性的三株链霉菌的发酵条件及生理生化性状研究

4.1 材料和方法

4.1.1 仪器

4.1.2 菌株和肿瘤细胞系

4.1.3 培养基

4.1.3.1 斜面培养基

4.1.3.2 种子培养基

4.1.3.3 发酵培养基

4.1.4 方法

4.1.4.1 斜面培养

4.1.4.2 菌株孢子丝的插片法观察

4.1.4.3 种子培养

4.1.4.4 活性菌株产活性物质的遗传稳定性考察研究

4.1.4.5 不同发酵培养基对活性物质产生的影响实验

4.1.4.6 活性菌株在不同发酵时间产活性物质的实验研究

4.1.4.7 不同通氧量对活性菌株发酵产生活性物质的影响

4.1.4.8 盐度对活性菌株产生活性物质的影响实验

4.1.4.9 活性物质的乙醇和丙酮沉淀实验

4.1.4.10 活性物质的极性确定实验

4.1.4.11 活性物质的热稳定性实验

4.1.4.12 活性物质的酸碱稳定性

4.1.4.13 活性物质的常温贮藏性实验

4.2 结果与分析

4.2.1 菌株050642、060386、060524的初步鉴定

4.2.2 发酵培养条件的选择

4.2.2.1 斜面培养基

4.2.2.2 活性菌株050642、060386和060524的遗传稳定性情况

4.2.2.3 不同发酵培养基对菌株050642、060386、060524产活性物质的影响

4.2.2.4 具细胞毒活性的三株菌株在不同发酵时间的产活情况

4.2.2.5 发酵培养基中的盐度对活性菌株的生长和细胞毒活性物质产生的影响实验

4.2.2.6 不同通氧量与活性物质产生的关系

4.2.3 菌株050642、060386和060524所产生的细胞毒活性物质的理化性质

4.2.3.1 活性物质的沉淀实验

4.2.3.2 活性物质的极性实验

4.2.3.3 活性物质的热稳定性实验

4.2.3.4 活性物质的酸碱稳定性实验

4.2.3.5 活性物质的耐贮藏性实验

4.3 小结与讨论

第五章 链霉菌菌株060524次级代谢产物的分离鉴定及其生物学活性研究

第一节 链霉菌菌株060524次级代谢产物的分离鉴定

5.1.1 材料和方法

5.1.1.1 仪器

5.1.1.2 菌株及细胞

5.1.1.3 种子培养基

5.1.1.4 提取与分离

5.1.1.5 结晶或单晶的培养

5.1.2 结果与分析

5.1.2.1 菌株060524次级代谢物各组分的化学结构鉴定

第二节 分离获得的次级代谢组分的生物活性

5.2.1 材料和方法

5.2.1.1 测试样品

5.2.1.2 测试肿瘤细胞株

5.2.1.3 测试菌株

5.2.1.4 培养基

5.2.1.5 试剂

5.2.1.6 供试样品原液的制备

5.2.1.7 细胞毒活性测定实验方法

5.2.1.8 细胞凋亡实验方法

5.2.1.9 抑菌活性的测定方法

5.2.1.10 酶抑制活性测试方法

5.2.2 结果与分析

5.2.2.1 细胞毒活性初筛测定结果

5.2.2.2 细胞毒活性细筛测定结果

5.2.2.3 具强细胞毒活性化合物的细胞凋亡实验结果

5.2.2.4 抗菌活性实验测定结果

5.2.2.5 酶抑制活性实验测定结果

5.3 小结与讨论

第六章 链霉菌菌株060524对异黄酮转化作用的研究

6.1 材料和方法

6.1.1 材料

6.1.2 方法

6.1.2.1 β-葡萄糖苷酶活性测定

6.1.2.2 链霉菌菌株060524生物转化大豆异黄酮的薄层法检测

6.1.2.3 不同发酵时间培养液中异黄酮甙和5种异黄酮苷元的定量分析研究

6.1.2.4 链霉菌菌株060524对大豆黄素和染料木素的转化作用研究

6.2 结果与讨论

6.2.1 链霉菌菌株060524的β-葡萄糖苷酶活性

6.2.2 链霉菌菌株060524对大豆黄素和染料木素的转化作用

6.2.3 不同培养时间发酵上清液中异黄酮各组分的含量

6.3 小结与讨论

总结与展望

创新点

参考文献

致谢

附录

博士在读期间已发表和待发表论文

化合物S1的部分谱图

化合物S2的部分谱图

化合物S3的部分谱图

化合物S4的部分谱图

化合物S5的部分谱图

化合物S6的部分谱图

化合物S7的部分谱图

化合物S8的部分谱图

化合物S9的部分谱图

化合物S10的部分谱图

化合物S11的部分谱图

化合物S12的部分谱图

化合物S13的部分谱图

发布时间: 2005-12-05

参考文献

• [1].齐墩果酸、18β-甘草次酸和熊果酸衍生物的合成及其细胞毒活性的初步探讨[D]. 冯菊红.浙江大学2006
• [2].从微生物代谢产物中发现具有细胞毒活性的化学成份[D]. 董悦生.中国协和医科大学2006
• [3].植物内生菌生物活性物质的研究[D]. 阮丽军.上海医药工业研究院2006
• [4].五种毛壳霉属和曲霉属真菌代谢产物及细胞毒活性[D]. 李国友.中国科学院研究生院（成都生物研究所）2007
• [5].新型多烯紫杉醇类似物的设计、合成及其抗肿瘤活性研究[D]. 陆洪福.复旦大学2011
• [6].Pt/Cu配合物诱导肿瘤细胞凋亡机制研究[D]. 刘雅红.天津医科大学2017
• [7].六株不同海洋生境来源真菌次级代谢产物化学结构和生物活性研究[D]. 郭文强.中国海洋大学2015
• [8].三株海洋微生物活性次级代谢产物研究[D]. 丁辉.浙江大学2017
• [9].吲哚并喹啉硼酸衍生物及全甲基化Neolamellarin A类似物的设计、合成与活性评价[D]. 尹瑞娟.中国海洋大学2013
• [10].甲氧基喜树碱的药代动力学研究[D]. 郑健.东北林业大学2013

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• [3].海洋放线菌抗MRSA菌株的筛选及菌株AM105活性物质的研究[D]. 黄惠琴.华南热带农业大学2005
• [4].海洋微生物次级代谢产物的研究[D]. 张海龙.沈阳药科大学2004
• [5].五种海洋微生物次级代谢产物的研究[D]. 姚遥.沈阳药科大学2007
• [6].红树植物内生放线菌的分离鉴定和2株海洋链霉菌活性代谢产物的分离鉴定[D]. 解修超.华南热带农业大学2007
• [7].八株海洋微生物次级代谢产物的研究[D]. 丁玲.中国科学院研究生院（海洋研究所）2008

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