糜子PmSAMS基因的燕麦转化及谷子DREB转录因子的克隆与表达模式分析

论文摘要

干旱已成为许多地区农业发展的瓶颈,因此改良作物抗旱性已迫在眉睫。挖掘作物抗旱基因是改良抗旱性的重要基础。糜子、谷子是抗旱性强和水分利用效率最高的作物,挖掘其抗旱相关基因,对作物抗旱性的遗传改良具有十分重要的理论和实际意义。本研究构建了由CaMV35S启动子调控的糜子抗旱基因PmSAMS基因的植物表达载体,并以燕麦的芽尖和花序作为外植体,采用农杆菌介导的原位转化和花序转化法进行转化,以期探讨利用糜子、谷子抗旱相关基因提高作物抗旱性的新途径。同时,对谷子的DREB基因进行了克隆,并采用半定量RT-PCR分析了其在水分胁迫和复水条件下的表达模式。主要研究结果如下:1.以糜子cDNA为模板,采用PCR扩增到糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长cDNA片段,结构域分析表明该编码蛋白具有S-腺苷甲硫氨酸合成酶典型的N端结构域、中间结构域和C端结构域。以植物表达载体pCAMBIA1305.2为基础,通过酶切连接糜子抗旱相关基因PmSAMS,成功构建了筛选标记为潮霉素抗性基因,含有启动子CaMV35S调控的PmSAMS基因植物表达载体p1305-SAMS。2.以燕麦芽尖和麦穗作为外植体,利用农杆菌介导法分别采用原位转化和花序侵染方式对构建的植物表达载体p1305-SAMS进行转化。通过潮霉素梯度浓度试验确定了燕麦转化子的筛选浓度（500mg/L）,对原位转化的燕麦幼苗和花序侵染后收获的燕麦种子进行筛选,获得了一株转PmSAMS基因的抗性植株,PCR检测初步表明PmSAMS已经整合到燕麦中。3.从谷子中分离到一个DREB基因的cDNA序列,该基因长1 113 bp,编码259个氨基酸,保守结构域分析表明具有DREB类转录因子典型的N-末端碱性核定位信号和高度保守的AP2/ERFBP结构域。半定量RT-PCR表达模式分析表明,谷子DREB基因的表达受干旱胁迫诱导,可能是谷子抗旱节水的关键基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 作物抗旱相关基因的研究进展
• 1.1.1 S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）
• 1.1.2 参与细胞信号转导和基因调控的抗旱相关基因
• 1.1.3 参与积累渗透保护物质相关抗旱基因
• 1.1.4 参与干旱胁迫下基因表达的转录因子
• 1.2 糜子、谷子的抗旱性及抗旱基因研究
• 1.2.1 糜子的抗旱性及抗旱基因研究
• 1.2.2 谷子抗旱性及抗旱基因研究
• 1.3 植物逆境胁迫相关基因的克隆方法
• 1.3.1 同源基因克隆
• 1.3.2 图位克隆
• 1.3.3 文库筛选
• 1.3.4 突变体的利用
• 1.3.5 功能蛋白组学方法
• 1.4 植物基因功能的分析方法
• 1.4.1 植物的遗传转化
• 1.4.1.1 影响根癌农杆菌介导植物基因转化的因素
• 1.4.1.1.1 根癌农杆菌的菌株类型
• 1.4.1.1.2 植物基因型及其外植体
• 1.4.1.1.3 再生植株的细胞起源
• 1.4.1.1.4 酚类化合物的使用
• 1.4.1.1.5 培养方法
• 1.4.1.1.6 筛选试剂
• 1.4.1.1.7 启动子
• 1.4.1.2 植物表达载体的构建
• 1.4.2 植物基因功能分析的其它方法
• 1.5 麦类作物的农杆菌转化方法研究
• 1.5.1 利用幼胚及胚性愈伤组织转化
• 1.5.2 利用花药和幼穗转化
• 1.5.3 植株整体转化
• 1.5.4 利用茎尖生长点的转化
• 1.5.5 转基因植株筛选方法研究
• 1.6 本研究的目的和技术路线
• 1.6.1 研究目的
• 1.6.2 技术路线
• 第二章 糜子抗旱相关基因SAMS 的表达载体的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 研究方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 糜子总RNA 的提取
• 2.2.2 PmSAMS 基因的PCR 扩增
• 2.2.3 PmSAMS 基因植物表达载体的构建
• 2.2.4 p1305-SAMS 导入根癌农杆菌
• 2.3 讨论
• 2.3.1 目的基因的选择
• 2.3.2 载体构建
• 第三章 糜子PmSAMS 基因对燕麦农杆菌介导转化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 潮霉素筛选浓度的确定
• 3.2.2 转化植株的筛选
• 3.2.3 转基因抗性植株PCR 检测
• 3.3 讨论
• 第四章 谷子DREB 转录因子基因的克隆及其在干旱胁迫下的表达模式分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 谷子DREB 基因的克隆及序列分析
• 4.2.2 半定量RT-PCR 循环数的确定
• 4.2.3 不同水分胁迫时间下DREB 的半定量RT-PCR 结果
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 5.1 植物表达载体p1305-SAMS 的构建
• 5.2 农杆菌介导的遗传转化
• 5.3 谷子DREB 基因在干旱胁迫下的表达模式分析
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介