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水稻根相关细菌的多相分类及Rheinheimera tangshanensis sp.nov.的描述

2020-11-28阅读(957)

水稻根相关细菌的多相分类及Rheinheimera tangshanensis sp.nov.的描述

论文摘要

本文采用Biolog为基础的数值分类、脂肪酸组成分析、16s rRNA、23S rRNA基因序列以及看家基因recA、atpD、gyrB、rpoB的系统发育分析、G+C mol%测定等技术,对分离自河北省滦南县种植的水稻根表及根内的42株与根瘤菌分类地位相近的菌株进行了多相分类、系统发育及相关特性研究;并对水稻根部分离的一株γ-变形菌纲着色杆菌科Rheinheimera属的新种进行了描述。根据16S rDNA部分序列进行初步的系统发育及聚类分析,发现42株菌分为4个类群,分别属于Agrobacterium、Allorhizobium、Sinorhizobium（Ensifer）、Rhizobium属;Biolog为基础的数值分类结果与16S rDNA部分序列系统发育分析基本一致;脂肪酸组成聚类分析可以将16S rDNA群Ⅲ（Agrobacterium属）的菌株明显地与其它类别分离开,而不能与Sinorhizobium（Ensifer）、Rhizobium以及Allorhizobium亲缘关系接近的株分开,但根据菌株的主要脂肪酸组成,可将它们归属于根瘤菌的范畴。16S rRNA基因全序列、recA、atpD、gyrB、rpoB和23S rRNA保守序列的系统发育分析进一步确定了各类群代表菌株的发育地位。rDNA群Ⅰ的代表菌株J3-46、J3-47-1、J3-44等位于Ensifer系统发育分支,供试菌株的各保守序列与E.adhaerens模式菌种同源性最高,除recA基因同源性为97%外,其它均接近100%,可以确定该类群的12株菌属于E.adhaerens,DNA G+Cmol%也证实这一结论;对于其他三个rDNA类群菌株的表型特征及保守基因的分析表明,供试菌株16S rDNA序列与已知模式菌株的序列同源性均小于97%或者接近97%:在recA、atpD、gyrB、rpoB和23S rRNA保守序列所构建的进化树上几乎全部单独形成一个独立的分支,与已知菌种序列相似性很低;Biolog聚类分析不能同模式菌株聚为一类;这些结果说明这三类菌株可能分别代表Agrobacterium、Allorhizobium和Rhizobium属中三个不同的新类群。对所分离的菌株与大豆、菜豆、三叶草、苜蓿四种豆科植物进行了结瘤试验,结果显示部分菌株可与苜蓿结瘤,而不能与其他三种豆科植物结瘤。在结瘤的菌株中,有三株菌属于E.adhaerens。野生型的E.adhaerens菌株与豆科植物结瘤的报道尚为鲜见。利用gfp基因成功标记了菌株J3-A127、J3-N43、J3-N19和J3-AN59,并应用激光扫描共聚焦显微镜在原位观察菌株对水稻幼苗根部的侵染情况,发现标记菌株可以定殖于水稻根面并进入根内,在根面的根尖部位、根部裂隙处、根毛发生处形成聚集体。对试验菌株的溶磷及分泌IAA的能力进行了测定,发现大部分菌株具有分泌IAA的能力,部分菌株同时具有溶磷功能,预示着可能具有农业应用价值。本研究发现一株Rheinheimera属的细菌,经多相分类确定为一个新种Rheinheimeratangshanensis sp.nov.并在IJSEM有效发表,是2002年发现Rheinheimera属以来所报道的第7个新种。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩写
  • 第一章 引言
  • 1.1 根际微生物的概念
  • 1.2 水稻根际固氮细菌的研究概况
  • 1.3 根瘤菌的生态多样性
  • 1.4 根瘤菌的分类进展
  • 1.5 根瘤菌的分类方法
  • 1.5.1 表型分类
  • 1.5.2 遗传型研究方法
  • 1.6.本文的立题依据
  • 第二章:材料与方法
  • 2.1 供试菌种
  • 2.2 形态学研究
  • 2.2.1 菌落形态
  • 2.2.2 细胞形态特征
  • 2.3 常规生理生化试验
  • 2.3.1 接触酶反应
  • 2.3.2 氧化酶反应
  • 2.3.3 耐盐性
  • 2.3.4 初始pH生长
  • 2.3.5 生长温度范围
  • 2.3.6 脲酶测定
  • 2.3.7 L-苯丙氨酸酶
  • 2.3.8 BTB检测
  • 2.3.9 3-酮基乳糖产生
  • 2.3.10 硝酸盐还原测定
  • 2.3.11 肉汁蛋白胨生长
  • 2.3.12 石蕊牛奶反应
  • 2.4 Biolog测定
  • 2.5 全细胞脂肪酸图谱分析
  • 2.5.1 收集菌体
  • 2.5.2 脂肪酸的提取
  • 2.5.3 脂肪酸（GC）分析
  • 2.6 菌体总DNA的提取与纯度检测
  • 2.6.1 基因组提取方法DNA
  • 2.6.2 纯度检查和浓度测定
  • 2.7 PCR扩增
  • 2.7.1 PCR扩增引物名称及序列
  • 2.7.2 PCR反应体系及条件
  • 2.8 电泳观察及序列测定
  • 2.9 系统发育分析
  • 2.10 G+Cmol%测定
  • 2.11 水稻侵染试验
  • 2.11.1 试验菌株的gfp基因标记
  • 2.11.2 水稻侵染试验
  • 2.12 供试菌种与豆科植物的结瘤试验
  • 2.13 16S rDNA的ARDRA分析
  • 2.13.1 PCR扩增体系
  • 2.13.2 ARDRA分型
  • 2.13.3 序列测定与同源性比对
  • 2.14 供试菌种溶磷作用及IAA产生的测定
  • 2.14.1 溶磷作用检测
  • 2.14.2 IAA产生测定
  • 第三章 结果与讨论
  • 3.1 常规生理生化结果分析
  • 3.2 16S rDNA部分基因序列测定及系统发育学分析
  • 3.3 Biolog结果及数值分类分析
  • 3.4 细胞脂肪酸分析
  • 3.5 16S rDNA全序列测定及其他保守基因的序列测定和系统发育分析
  • 3.5.1 16S rDNA全序列测定和系统发育分析
  • 3.5.2 其他保守基因的序列测定和系统发育分析
  • 3.6 G+Cmol%的测定
  • 3.7 部分菌株与豆科植物的结瘤试验结果
  • 3.8 试验菌株对水稻侵染试验
  • 3.9 对原采集地土样中细菌的16S rDNA-ARDRA的分析
  • 3.10 部分试验菌株产IAA及溶磷功能的初探
  • 3.11 小结
  • 第四章:一株水稻根相关细菌JA3-B52 Rheinheimera tangshanensis sp.nov.的菌种鉴定
  • 4.1 实验材料与方法
  • 4.1.1 菌株的分离、培养与保藏
  • 4.1.2 形态学研究
  • 4.1.3 生理生化特征
  • 4.1.4 脂肪酸的测定
  • 4.1.5 DNA分析
  • 4.2 结果
  • 4.2.1 形态和培养特征
  • 4.2.2 脂肪酸组成
  • 4.2.3 进化分析
  • 4.2.4 遗传特征
  • 4.2.5 生化和生理特性
  • 4.3 讨论
  • 4.4 新种Rheinheimera tangshanensis sp.nov.的描述
  • 结论
  • 参考文献
  • 附件1:生理生化结果
  • 附件2:Biolog结果
  • 附件3:供试菌株16S rDNA序列GenBank注册号
  • 附件4:供试菌株atpD基因序列GenBank注册号
  • 附件5:供试菌株recA基因序列GenBank注册号
  • 致谢
  • 博士期间发表的文章

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