休眠期间苣荬菜芽根蛋白质组的双向电泳分析及质谱鉴定

论文摘要

苣荬菜（Sonchus brachyotus DC.）为菊科苦苣菜属多年生草本植物,是东北地区危害大豆的“三菜”之一,给农业生产造成极大的损失。现有除草剂只对苣荬菜的地上部分有防除效果,对地下部分却无能为力。根本原因是除草剂在苣荬菜的地下芽根中传导能力差,而且苣荬菜的地下部分能以休眠的方式渡过寒冷的冬季,翌年继续危害。本研究利用双向电泳及质谱技术检测了休眠过程中苣荬菜芽根蛋白质组的动态变化,寻找并鉴定差异蛋白点,旨在找到与休眠相关的蛋白质,以探索其休眠机制,为防除苣荬菜提供新的思路。目前,国内外均未见上述研究报道。本研究以多年生杂草苣荬菜的地下芽根为试验材料,对其进行了两方面的研究。首先对苣荬菜芽根总蛋白质的提取方法进行筛选并建立适合苣荬菜的双向电泳分析体系,其次对休眠过程中不同时间点的苣荬菜取样并进行双向电泳分析,找到差异蛋白点,并对这些蛋白点进行质谱分析。主要研究结果如下:（1）确定Trizol沉淀法作为苣荬菜芽根总蛋白质的提取方法。以蛋白纯度及SDS-PAGE电泳的分离效果为指标,比较了TCA-丙酮沉淀法、酚法、Tris-Hcl法、Tris-丙酮-酚法、Trizol沉淀法、苯酚-TCA-丙酮沉淀法、双乙法七种方法提取的苣荬菜芽根的总蛋白,结果表明,Trizol沉淀法提取的苣荬菜芽根的蛋白纯度最高,且SDS-PAGE电泳条带最多、最清晰,双向电泳图谱清晰,蛋白点最多,基本没有拖尾和横纵条纹,是苣荬菜芽根总蛋白质的最佳提取方法。（2）建立并优化了适合苣荬菜的SDS-PAGE电泳和双向电泳分析体系。SDS-PAGE电泳:采用5%的浓缩胶和12%的分离胶,上样量为15μg,样品在浓缩胶时,电流为10mA;到达分离胶后,电流为40mA,当溴酚蓝至胶底时电泳结束。双向电泳:第一向等电聚焦使用24cm线性IPG胶条（PH=4-7）,取约含1200μg总蛋白质的450μL水化液,采用被动水化上样,水化14 h。等电聚焦在20℃下进行,50 V,30 min; 100 V,1 h;300 V,1 h;500 V,1 h;1000 V,1 h;2000 V,1 h;5000 V,1 h;8500 V,80000Vhr;500 V,1 h。电泳结束后将胶条依次用含有DTT和含有碘乙酰胺的平衡液各平衡15 min。第二向电泳采用12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶,预电泳45 min,2w/胶;正式电泳5-6 h,15w/胶。凝胶采用热考染法进行染色。（3）通过质谱分析46个差异蛋白点,得到45个具有统计学意义的蛋白质点,其中有16个蛋白与能量代谢相关,9个蛋白与植物逆境生理相关,4个蛋白与植物体抗氧化相关,3个蛋白与细胞壁合成相关,3个蛋白与蛋白质水解相关,2个蛋白与信号转导相关及8个未知蛋白。表明休眠期间苣荬菜芽根中多个生理过程发生了变化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 苣荬菜的研究概述
• 1.1.1 苣荬菜的分布与危害
• 1.1.2 苣荬菜的形态特征
• 1.1.3 苣荬菜的发生特点
• 1.1.4 苣荬菜的防除技术
• 1.2 植物休眠的研究进展
• 1.2.1 植物休眠的概念及类型
• 1.2.2 植物休眠过程中生理指标的变化规律
• 1.2.3 多年生杂草休眠的研究现状
• 1.3 植物蛋白质组学研究进展
• 1.3.1 蛋白质组学的产生和相关概念
• 1.3.2 蛋白质组学研究的方法和技术
• 1.4 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验试剂
• 2.1.3 试验仪器
• 2.1.4 试验中所用主要试剂配方
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 蛋白质提取方法
• 2.2.2 蛋白质纯化方法
• 2.2.3 蛋白质浓度测定
• 2.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（1D SDS-PAGE）
• 2.2.5 双向电泳（2-DE）
• 2.2.6 蛋白质点的切取及胶内酶解
• 2.2.7 蛋白点的质谱分析与数据库检索
• 3 结果与分析
• 3.1 苣荬菜芽根蛋白质双向电泳技术体系的建立
• 3.1.1 七种提取方法所得蛋白质量及纯度的比较
• 3.1.2 七种提取方法所得蛋白的SDS-PAGE 结果比较
• 3.1.3 Tris-丙酮-酚法与Trizol 沉淀法的双向电泳结果比较
• 3.2 双向电泳分析方法的重复性分析
• 3.3 休眠期间苣荬菜芽根的差异蛋白分析
• 3.3.1 休眠期间苣荬菜芽根的差异蛋白点
• 3.3.2 差异蛋白点的丰度变化
• 3.4 休眠期间苣荬菜芽根差异蛋白的质谱鉴定及功能分析
• 3.4.1 差异蛋白点的鉴定结果
• 3.4.2 差异蛋白点的生物信息学分析
• 4 讨论
• 4.1 关于苣荬菜芽根蛋白质提取方法的选择
• 4.2 关于双向电泳条件的确定
• 4.3 关于休眠过程中苣荬菜芽根差异蛋白点功能的探讨
• 4.3.1 与能量代谢相关的差异蛋白
• 4.3.2 与植物抗氧化相关的差异蛋白
• 4.3.3 与植物逆境生理相关的差异蛋白
• 4.3.4 与植物细胞壁合成相关的差异蛋白
• 4.3.5 与蛋白水解相关的差异蛋白
• 4.3.6 与信号转导相关的差异蛋白
• 4.3.7 未知蛋白与假想蛋白
• 5 结论
• 5.1 确定了Trizol 沉淀法为苣荬菜芽根总蛋白质的提取方法
• 5.2 建立了适合苣荬菜芽根的SDS-PAGE 和双向电泳分析体系
• 5.3 休眠期间苣荬菜芽根的差异蛋白
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文