山羊毛囊干细胞及组织工程皮肤构建研究

论文摘要

组织工程皮肤自发展20多年来取得了很大的进展,目前已有数种组织工程皮肤应用于临床,为大面积烧伤以及和各种原因引起的皮肤大面积溃烂患者带来了福音。但是,已有的组织工程皮肤只是在结构上具有了皮肤的屏障功能,而不能形成毛囊、汗腺和皮脂腺等皮肤附属器官。临床移植后发现,创面干燥、皴裂、缺乏韧性和弹性等,给患者造成一定的痛苦。因此,构建具有毛囊、汗腺等皮肤附属器官的组织工程皮肤是未来组织工程发展的方向。研究发现,皮肤中的干细胞主要位于毛囊外根鞘隆突部位,毛囊干细胞具有多能性,它们在相关信号的作用下,可向上迁移参与皮脂腺和表皮的形成,向下迁移参与毛囊的形成。因此,以毛囊干细胞为种子细胞构建具有毛囊的组织工程皮肤,是一个理想的方案。但是由于毛囊干细胞存在部位隐蔽,缺乏特异性表面标志,从而限制了毛囊干细胞的体外研究和应用。本研究从山羊毛囊干细胞分离、培养、生物学特性以及分化潜能等方面进行了研究,并以毛囊干细胞和毛囊真皮细胞为种子细胞构建组织工程皮肤。主要内容包括:1.山羊毛囊干细胞分离培养体系的建立（1）将关中奶山羊耳部皮肤样本清洗干净剪碎后,用0.5%的胶原酶I,37℃消化1.5～2h,在体视显微镜下分离、挑选出完整毛囊,用0.25 %胰酶消化毛囊,37℃消化20～30min,获得单个细胞。将细胞以5×105/mL的密度分别接种与20μg/mL IV胶原包被的6孔板中,20min后,吸出未贴附细胞,加入无血清培养液培养（DMEM/F12 +2%BSA+5μg/mLInsulin+0.5μg/mLHydrocortisone+10ng/mLEGF+10 ng/mL IGF +10%条件培养基）,5d后消化传代。（2）对比了DMEM/F12和F12基础培养体系以及不同浓度的EGF、IGF-1以及条件培养液对山羊毛囊干细胞增殖的影响,筛选出以DMEM/F12 +2%BSA +5μg/mLInsulin+0.5μg/mLHydrocortison+15ng/mLEGF+10ng/mLIGF-1+20%条件培养液为山羊毛囊干细胞的优化培养体系。在此培养体系中,山羊毛囊干细胞可连续传至19代。2.山羊毛囊干细胞生物学特性研究（1）本研究所分离的毛囊干细胞为上皮细胞形态,在体外呈克隆性生长;电镜观察显示,细胞表现出原始细胞特征:细胞体积小,直径≤10μm;细胞表面微绒毛发达;核质比高;核内以常染色质为主,异染色质少,细胞器不发达等。（2）细胞生长曲线显示,前13代细胞生长良好,至16代,增值能力有所下降。这可能是随着细胞传代的增加,体外培养条件不能维持其未分化状态。分离的山羊毛囊干细胞液氮冷冻保存2×108,解冻成活率≥95%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 皮肤结构与皮肤干细胞
• 1.1 皮肤的组成结构
• 1.2 毛囊、汗腺、皮脂腺关系
• 1.3 皮肤干细胞
• 1.4 表皮干细胞和毛囊干细胞
• 第二章 表皮干细胞研究概况
• 2.1 表皮干细胞分布模式学说
• 2.1.1 表皮增殖单位（Epidermal Proliferation unit. EPU）学说
• 2.1.2 网状嵴分布模式
• 2.2 表皮干细胞的特点
• 2.3 表皮干细胞表面标志
• 2.3.1 整合素家族
• 2.3.2 角蛋白（keratin）
• 2.3.3 P63 转录因子
• 2.3.4 Connexi1143（Cx43）连接蛋白
• 2.4 表皮干细胞应用前景
• 第三章 毛囊及毛囊干细胞
• 3.1 毛囊的胚胎发生
• 3.2 毛囊组成结构
• 3.3 毛囊的生长周期
• 3.4 毛囊各种细胞生物学特性研究
• 3.4.1 毛乳头细胞
• 3.4.2 毛囊真皮鞘成纤维细胞
• 3.4.3 毛囊真皮细胞成分在皮肤创伤修复中的应用
• 3.4.4 毛囊干细胞研究
• 第四章 成体干细胞可塑性研究
• 4.1 成体干细胞可塑性概念的提出
• 4.2 成体干细胞可塑性研究概况
• 4.2.1 骨髓干细胞可塑性研究
• 4.2.2 神经干细胞可塑性研究
• 4.2.3 肝脏干细胞可塑性研究
• 4.2.4 皮肤干细胞可塑性
• 4.2.5 其他组织干细胞可塑性
• 4.3 成体干细胞可塑性分化机制
• 4.4 成体干细胞可塑性引发的争议
• 4.5 成体干细胞可塑性引发的思考
• 4.5.1 在不同组织中是否存在一种统一的干细胞（Universal Stem Cell）
• 4.5.2 建立评价成体干细胞可塑性的标准
• 4.6 结论和前景
• 第五章 组织工程皮肤研究进展
• 5.1 组织工程学概念及原理
• 5.2 组织工程皮肤种类
• 5.2.1 表皮替代物
• 5.2.2 真皮替代物
• 5.2.3 人工全层皮肤
• 5.3 组织工程皮肤临床应用
• 5.3.1 Integra
• 5.3.2 Apligraft
• 5.3.3 Dermagraft
• 5.3.4 AlloDerm
• 5.4 存在问题及展望
• 5.4.1 种子细胞问题
• 5.4.2 支架材料
• 实验研究
• 第六章 山羊毛囊干细胞分离培养方法研究
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 不同浓度的IV 胶原对毛囊干细胞富集的影响
• 6.2.2 不同粘附时间对毛囊干细胞富集的影响
• 6.2.3 粘附法对毛囊干细胞富集的影响
• 6.2.4 毛囊干细胞在不同培养液中增殖特征
• 6.2.5 不同浓度的EGF 对毛囊干细胞克隆形成率的影响
• 6.2.6 不同浓度的IGF-1 对毛囊干细胞克隆形成率的影响
• 6.2.7 不同浓度的条件培养液对毛囊干细胞克隆形成率的影响
• 6.3 讨论
• 6.3.1 山羊毛囊干细胞分离方法探讨
• 6.3.2 山羊毛囊干细胞培养体系的筛选
• 6.4 小结
• 第七章 山羊毛囊干细胞生物学特性
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 方法
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 山羊毛囊干细胞形态特征
• 7.2.2 山羊毛囊干细胞扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）分析
• 7.2.3 山羊毛囊干细胞透射电镜（transmission electron microscope，TEM）分析
• 7.2.4 山羊毛囊干细胞生长曲线分析
• 7.2.5 山羊毛囊干细胞冷冻解冻效果
• 7.2.6 山羊毛囊干细胞表面标志的免疫组化检测
• 7.3 讨论
• 7.3.1 山羊毛囊干细胞形态特征
• 7.3.2 山羊毛囊干细胞生长曲线分析
• 7.3.3 山羊毛囊干细胞的细胞的冷冻与复苏
• 7.3.4 山羊毛囊干细胞表面标志检测
• 7.4 小结
• 第八章 山羊毛囊干细胞诱导分化
• 8.1 材料和方法
• 8.1.1 材料
• 8.1.2 方法
• 8.2 结果与分析
• 8.2.1 山羊毛囊干细胞向心肌细胞分化
• 8.2.2 山羊毛囊干细胞向成骨细胞分化
• 8.2.4 山羊毛囊干细胞向神经细胞分化
• 8.3 讨论
• 8.3.1 山羊毛囊干细胞向心肌诱导分化
• 8.3.2 山羊毛囊干细胞向成骨诱导分化
• 8.3.3 山羊毛囊干细胞向脂肪诱导分化
• 8.3.4 山羊毛囊干细胞向神经诱导分化
• 8.4 小结
• 第九章 山羊组织工程皮肤构建及移植效果检测
• 9.1 材料和方法
• 9.1.1 材料
• 9.1.2 方法
• 9.2 结果与分析
• 9.2.1 羊膜可有效地降低胶原凝胶的收缩
• 9.2.2 组织工程皮肤检测
• 9.2.3 组织工程皮肤移植及观察
• 9.3 讨论
• 9.3.1 真皮支架的制作
• 9.3.2 毛囊干细胞、毛囊真皮细胞在毛囊形成中的作用
• 9.4 小结
• 结论
• 本研究创新点
• 下一步工作设想
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历