牛乳腺上皮细胞的体外培养及转染hTERT基因后相关生理特征检测

论文摘要

乳腺上皮细胞由于直接取材乳腺组织,含有乳腺分泌功能的一些基因调控元件,所以被作为乳腺特异性表达载体的转染细胞,用于进行转基因动物和乳腺反应器的生产。但是正常的乳腺细胞体外培养传代代数有限,不能满足基因打靶等多次细胞转染的需求,所以乳腺细胞永生化的研究为解决这一问题的有效途径。本研究采用3种不同的方法进行牛乳腺细胞的体外培养,并对转有外源基因hTERT的乳腺上皮细胞进行了相关生理特征研究,为乳腺细胞永生化的研究进行了一些基础性的探索。主要实验结果如下:1、采用组织贴壁培养法、I型胶原酶、II型胶原酶消化培养法和胰蛋白酶选择性消化法分离、培养和纯化牛乳腺上皮细胞。利用形态学观察比较了牛乳腺细胞的生长、迁移、分化和凋亡等一系列特征。2、构建了携带报告基因EGFP的人端粒酶催化亚基（hTERT）基因融合表达载体,并转染牛乳腺上皮细胞,进行了核型分析、免疫荧光染色观察角蛋白5和角蛋白8,鉴定培养的细胞为乳腺上皮细胞,并转入了hTERT基因。表明乳腺上皮细胞传代到第三代,载体浓度为350ng/ul时转染效率最高,为25%。3、选用含有人端粒酶催化亚基（hTERT）基因融合表达载体pEGFP-hTERT转染牛乳腺上皮细胞的阳性克隆细胞,进行RT-PCR检测细胞基因整合、流式细胞术检测转染细胞的增殖能力及周期。表明,hTERT可以整合在牛乳腺上皮细胞基因组中并表达端粒酶蛋白,并且在导入hTERT基因后,细胞增殖能力增强,能延长体外培养的牛乳腺上皮细胞的寿命。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 动物乳腺细胞培养研究进展
• 1.1.1 乳腺的结构
• 1.1.2 动物细胞培养研究进展
• 1.1.3 动物细胞培养发展简史
• 1.1.4 牛乳腺细胞的研究进展
• 1.1.5 乳腺细胞培养方法研究进展
• 1.1.6 乳腺上皮细胞的分离
• 1.1.7 乳腺上皮细胞体外培养研究概况
• 1.2 转基因技术应用研究进展
• 1.3 转基因动物应用的现状及前景
• 1.3.1 转基因动物在医学中的应用
• 1.3.2 利用转基因动物乳腺生物反应器生产药用蛋白
• 1.3.3 利用转基因动物生产抗体
• 1.3.4 利用转基因动物生产血液成分替代品
• 1.3.5 转基因猪作为医学器官移植的来源
• 1.3.6 用转基因家畜制作人类疾病的动物模型
• 1.3.7 人畜共患病的防治
• 1.4 转基因动物在农业中的应用
• 1.4.1 改善肉质
• 1.4.2 生长率、饲料利用率的提高
• 1.4.3 乳质的改善
• 1.4.4 毛用产品
• 1.4.5 转基因动物及抗病性
• 1.5 端粒，端粒酶研究进展
• 1.5.1 端粒
• 1.5.2 端粒酶
• 第二章 牛乳腺上皮细胞体外培养研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 动物材料
• 2.1.2 实验器材
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 组织块制备
• 2.2.2 组织块培养法牛乳腺上皮细胞的体外培养
• 2.2.3 消化法培养牛乳腺上皮细胞的体外培养
• 2.2.4 细胞生长曲线测定
• 2.3 结果
• 2.3.1 三种培养方法原代结果
• 2.3.2 三种培养方法传代结果
• 2.3.3 细胞生长曲线绘图
• 2.3.4 三种方法获得乳腺细胞生长特性
• 2.4 讨论
• 第三章 绿色荧光蛋白融合表达载体的构建及转染效率研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 质粒和菌株
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 pEGFP-hTERT 真核表达载体的构建
• 3.2.2 新霉素（G418）最佳筛选浓度的确定
• 3.3 结果
• 3.3.1 重组载体pEGFP-htert 载体构建示意图
• 3.3.2 pEGFP-hTERT 真核表达载体的鉴定
• 3.3.3 转染结果
• 3.3.4 转染效率结果统计学分析
• 3.3.5 转融合蛋白的乳腺上皮细胞的类型鉴定
• 3.4 讨论
• 3.4.1 采用质脂体法转染牛乳腺上皮细胞
• 3.4.2 影响牛乳腺细胞体外转基因效率的因素
• 第四章 牛乳腺上皮细胞转端粒酶基因及相关生物学鉴定
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 质粒和菌株
• 4.1.2 主要实验试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 融合表达载体pEGFP-TERT 纯化
• 4.2.2 重组表达质粒转染牛乳腺上皮细胞
• 4.2.3 G418 筛选及阳性细胞的获得
• 4.2.4 RNA 提取及RT-PCR
• 4.2.5 牛乳腺上皮细胞的核型分析
• 4.2.6 流式细胞仪检测细胞周期
• 4.3 结果
• 4.3.1 RT- PCR 分析
• 4.3.2 核型分析结果
• 4.3.3 细胞周期图结果检测
• 4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录一
• 英文缩略词表
• 致谢
• 作者简介