家蚕Tudor-SN基因的鉴定及功能分析

论文摘要

自1998年在线虫中发现RNAi现象以来的10余年间,利用RNAi手段研究基因功能已经广泛应用于各种物种中。随着对RNAi机制的解析,研究者们发现参与这种保守机制的蛋白在不同的物种中其实不完全相同,并且其中还有很多蛋白的功能没有得到诠释。Tudor-SN（TSN）蛋白就是其中之一,虽然是最早被发现的沉默复合体（RISC）成员蛋白,但其功能至今为止仍然不清楚。TSN蛋白具有保守的4个完整的SN结构域,一个Tudor结构域以及一个含部分序列的第五SN结构域,保守存在于各物种中。该蛋白在不同的生物体内参与不尽相同的调控途径,且在同一物种中往往具有多种功能,如：参与激活转录因子mRNA剪切、转录后调控、降解被修饰的miRNA等。TSN复杂的结构决定了其作为多功能蛋白参与不同途径。对于鳞翅目昆虫的代表家蚕而言,IRNAi也是研究其基因功能的有力工具之一,但是关于家蚕干涉途径机制解析的报道却很少。本研究以家蚕TSN为对象,通过克隆该基因的CDS,分析了其预测氨基酸序列特征；采用免疫染色对其进行亚细胞定位；在家蚕细胞中利用荧光双分子互补实验验证家蚕TSN蛋白和AGO1以及AGO2蛋白的相互作用；构建转基因表达环状荧光素酶细胞系来检测降低tsn基因的表达是否引起caspase3介导的细胞凋亡。在此基础上,对tsn基因进行瞬时干涉检测其在家蚕RNAi途径中的作用,同时构建转基因过量表达tsn基因的细胞系检测其是否有助于提高干涉效率。主要的结果如下：1.家蚕tsn基因的序列分析以及表达特征分析克隆获得的家蚕tsn基因cDNA序列为3362bp,其中包括2667bp的ORF,186bp的5’UTR和509bp的3’UTR。ORF编码含888个氨基酸的蛋白,分子量为98.88kD,等电点为8.55。该蛋白包含4个完整的SN结构域,一个含部分序列的SN结构域以及一个Tudor结构域,其中在Tudor结构域中包含5个决定其芳香笼状结构的保守氨基酸残基。对TSN蛋白质氨基酸序列进行多序列比对,发现家蚕的TSN蛋白氨基酸序列与果蝇、线虫和人类分别具有52%、51%和43%的相同性,分别具有70%、67%和63%的相似性。通过RT-PCR发现家蚕tsn基因在检测的家蚕10个组织中都有表达,主要在精巢,卵巢以及丝腺中有较高量的转录,相反,在血液和马氏管中的表达量相对较少。通过免疫染色发现,家蚕tsn基因主要在BmN4细胞的细胞质中表达。2.家蚕TSN与AGO1和AGO2之间的相互作用在家蚕细胞中利用荧光双分子互补实验（BiFC）验证家蚕TSN蛋白和AGO1以及AGO2蛋白的相互作用,发现家蚕TSN蛋白和AGO1以及AGO2蛋白在细胞质中形成复合体,这个复合体可能存在于某个细胞器中。由于AGO1和AGO2在P-boby中参与mRNA翻译抑制,结合本实验研究结果,我们推测TSN可能在P-body中协助AGO1和AGO2参与mRNA翻译抑制。3.家蚕BmN4细胞内RNA编辑与RNA干涉途径之间的拮抗作用分析最近的报道表明一些物种中A到I的RNA编辑对RNA干涉途径具有抑制作用。被RNA编辑酶ADAR修饰后的dsRNA不能进入RNA干涉途径,而被ADAR修饰后的dsRNA会被TSN蛋白结合并降解。家蚕基因组中也存在adar基因,通过RT-PCR发现家蚕adar基因主要在头和表皮中有表达。在家蚕细胞中我们通过干涉adar和tsn基因,以荧光素酶基因为报道基因检测干涉效率,发现共转染72小时后,干涉了adar和tsn基因后并没有影响干涉效率。这表明在我们的实验条件下,RNA编辑对RNA干涉途径并没有明显的拮抗作用。4.抑制家蚕adar基因和tsn基因后对家蚕BmN4细胞引起的凋亡检测由于考虑至ADAR蛋白的修饰作用以及TSN蛋白作为一种多功能蛋白为生物体或者是细胞生存所必须,再者,已有研究发现沉默了挪威云杉tsn基因表达后会引起植物细胞异常的细胞死亡并影响其植物体的繁殖力,因此干涉这两个基因后可能会引起细胞凋亡。所以我们构建转基因表达环状荧光素酶的细胞系来检测caspase3引起的细胞凋亡。但结果发现,在抑制adar和tsn基因后,从细胞形态上以及分子水平上与过量表达人p53基因的阳性对照比较都没有发现细胞凋亡现象。5.抑制与过量表达家蚕tsn基因对家蚕BmN4细胞中干涉效率的影响分析采用瞬时干涉检测的方法,即在转染双链RNA后24到48小时内检测干涉效率,利用不同剂量的tsn基因对应的dsRNA转染36小时后发现,2.5ng到40ng的dsRNA剂量之间报告基因的表达量逐渐升高,说明干涉效率逐渐下降。而80ngdsRNA处理后干涉效率反而有所提高。我们推测,前者是由于干涉掉tsn基因而影响到了干涉效率,后者是由于dsRNA剂量太高而产生的非特异干涉现象。同时,我们构建了转基因过量表达tsn基因的细胞系,并且比较了这种细胞系和正常细胞的干涉效率,发现干涉效率并没有因为tsn基因的过量表达而升高。综上所述,本研究在细胞水平上,通过亚细胞定位鉴定出家蚕tsn基因在细胞质中表达；通过荧光双分子实验验证出家蚕TSN蛋白和AGO1以及AGO2蛋白之间分别相互作用；构建转基因表达环状荧光素酶的细胞系检测干涉,并发现干涉家蚕adar基因和tsn基因后并不能引起caspase3介导的细胞凋亡；同时以荧光素酶为报告基因检测A到I的RNA编辑是否对RNAi途径具有拮抗作用,研究发现BmN4细胞中RNA编辑对RNAi途径的拮抗作用并不明显；为了详细研究TSN在家蚕RNAi途径中的作用,我们采取瞬时干涉检测的方法发现TSN在家蚕RNAi金径中行使着一定的作用；而转基因过量表达tsn基因发现并没有提高干涉效率。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 概述
• 1.2 各类小RNA的产生机制
• 1.2.1 siRNA的产生
• 1.2.2 miRNA的产生
• 1.2.3 piRNA的产生
• 1.3 环境RNAI
• 1.3.1 环境RNAi的定义
• 1.3.2 环境RNAi的相关蛋白
• 1.4 RNAI正负调控因子的研究进展
• 1.4.1 RDRP对siRNA的扩增效应
• 1.4.2 Eri1对siRNA的降解作用
• 1.4.3 ADAR对dsRNA或siRNA的修饰作用
• 1.5 TSN基因的功能研究进展
• 1.5.1 TSN是一种多功能蛋白
• 1.5.2 TSN在RNAi途径中的作用
• 1.6 家蚕RNAI途径中相关蛋白的研究进展
• 第二章 引言
• 2.1 研究背景及意义
• 2.2 主要研究内容
• 2.3 研究技术路线
• 第三章 家蚕tsn基因的序列分析以及表达特征分析
• 3.1 实验材料与试剂
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要溶液的配制
• 3.2 实验方法与步骤
• 3.2.1 家蚕tsn基因全长ORF的获得
• 3.2.2 家蚕tsn基因的信息分析
• 3.2.3 家蚕tsn基因的组织表达谱以及亚细胞定位
• 3.3 实验结果与分析
• 3.3.1 家蚕tsn基因全长ORF序列以及推测的氨基酸序列
• 3.3.3 tsn基因在不同的物种中高度保守
• 3.3.4 家蚕tsn基因的组织表达谱
• 3.3.5 家蚕tsn基因的亚细胞定位
• 3.4 讨论
• 第四章 家蚕TSN与AGO1和AGO2之间的相互作用
• 4.1 实验材料与试剂
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 实验仪器
• 4.1.4 主要溶液的配制
• 4.2 实验方法与步骤
• 4.2.1 载体的构建
• 4.2.2 双分子荧光互补（BiFC）实验
• 4.3 实验结果与分析
• 4.3.1 目的载体的构建
• 4.3.2 家蚕TSN与AGO1和AGO2之间的相互作用
• 4.4 讨论
• 第五章 家蚕RNA编辑与RNA干涉途径的相互拮抗作用分析
• 5.1 实验材料与试剂
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验试剂
• 5.1.3 实验仪器
• 5.1.4 主要溶液的配制
• 5.2 实验方法与步骤
• 5.2.1 dsRNA的制备
• 5.2.2 细胞转染
• 5.2.3 报告基因荧光素酶的检测
• 5.2.4 western杂交
• 5.3 实验结果与分析
• 5.4.1 家蚕adar基因的组织表达谱
• 5.4.2 家蚕RNA编辑和RNA干涉途径的拮抗作用检测
• 5.4 讨论
• 第六章 抑制家蚕ADAR基因和TSN基因后对家蚕BMN4细胞引起的凋亡检测
• 6.1 实验材料与试剂
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 实验试剂
• 6.1.3 实验仪器
• 6.1.4 主要溶液的配制
• 6.2 实验方法与步骤
• 6.2.1 dsRNA的制备
• 6.2.2 家蚕细胞凋亡检测载体的构建
• 6.2.3 细胞转染
• 6.2.4 转基因细胞系的构建
• 6.2.5 报告基因荧光素酶的检测
• 6.3 实验结果与分析
• 6.3.2 表达环状荧光素酶转基因细胞系细胞凋亡检测
• 6.3.3 干涉家蚕RNA编辑途径相关蛋白后细胞凋亡检测
• 6.4 讨论
• 第七章 抑制与过量表达家蚕TSN基因对家蚕BMN4细胞中干涉效率的影响
• 7.1 实验材料与试剂
• 7.1.1 实验材料
• 7.1.2 实验试剂
• 7.1.3 主要仪器
• 7.1.4 主要溶液的配制
• 7.2 实验方法与步骤
• 7.2.1 dsRNA的制备
• 7.2.2 载体构建
• 7.2.3 细胞转染
• 7.2.4 转基因细胞的构建
• 7.2.5 报告基因荧光素酶的检测
• 7.2.6 western杂交
• 7.3 实验结果与分析
• 7.3.1 不同剂量dsRNA对tsn基因干涉抑制后对RNAi效率的影响
• 7.3.2 转基因过量表达tsn基因对RNAi效率的影响
• 7.4 讨论
• 第八章 小结
• 8.1 TSN基因的表达模式暗示其编码一个结构上保守的多功能蛋白
• 8.2 家蚕TSN蛋白和AGO1以及AGO2蛋白具有相互作用的关系
• 8.3 家蚕BMN4细胞中A到I的RNA编辑和RNA干涉之间没有明显的拮抗作用
• 8.4 抑制家蚕ADAR基因和TSN基因不会引起CASPASE3介导的细胞凋亡
• 8.5 家蚕TSN蛋白在RNAI途径中起着一定的作用
• 参考文献
• 在读期间发表论文及参研课题情况
• 致谢