腺病毒介导的自杀基因HSV-TK/GCV系统对骨关节炎增殖滑膜细胞的作用的实验研究

论文摘要

目的骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种退行性骨关节病，滑膜的炎性增生反应是关节结构破坏的重要参与者，促进了OA的病程进展。OA发生时滑膜增生，超微结构观察呈现功能活跃相。OA严重危害老年人健康，是长期丧失劳动力的重要原因之一。但至今对OA的治疗效果和方便程度无法令人满意。基因治疗OA的研究也在进行中，促进了对OA的治疗。本课题是利用自杀基因选择性作用于增殖活跃细胞的机理，观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒-胸苷激酶（herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK）基因／丙氧鸟苷（ganciclovir，GCV）系统对OA增殖活跃的滑膜细胞的作用，初步研究其在OA基因治疗中的应用。材料和方法1带有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的重组腺病毒于我院中心实验室保存，重组腺病毒Ad CMV HSV-TK的扩增、纯化及滴度测定均由我院实验室完成，Ad-TK的病毒效价为1×1012。2取OA患者行膝关节置换时切下的滑膜组织，按Goto方法分离并传代培养。倒置相差显微镜观察细胞生长情况。取第三代滑膜细胞接种于24孔培养板上，分别加入不同滴度的Ad-TK，第1孔加入PBS进行空白对照，感染24h。荧光显微镜下计数表达GFP的细胞百分率来测定细胞的感染效率，绘制感染效率曲线。3滑膜细胞接种于96孔板上，加入100moi的病毒液感染24h，以未感染的细胞作为对照。分别加入不同浓度的GCV。48 h后加入MTT，4h后测定各孔的吸光值（A）。计算细胞的生长抑制率=（1-实验孔A值／对照孔A值）×100％。将感染100 moi病毒的滑膜细胞按所占比例分别为20％、40％、60％、80％同未感染的细胞混合24 h接种于96孔板上，以未感染的细胞作为对照。加入10mg／l的GCV 48h。MTT法测吸光值计算细胞抑制率。4 100 moi的Ad-TK感染滑膜细胞24h后，给予10mg／l GCV，于0、12、24、48h分别置倒置显微镜下观察细胞形态变化；100 moi的Ad-TK感染滑膜细胞24h后，给予10mg／l GCV，48h后用Hoechst 33342／PI染色、固定，将细胞悬液滴在载玻片上，加盖玻片，用荧光显微镜观察、计数。5 100 moi的Ad-TK感染滑膜细胞24h后，给予10mg／l GCV 48h后消化、离心、回收所有细胞，加入Annexin V-FITC、PI；流式细胞仪上机检测。结果1滑膜细胞贴壁后，镜下可见三种类型的细胞，即树突样细胞（DCs）、巨噬细胞样细胞（MCs）和成纤维细胞样细胞（FCs），以FCs成分为主。当培养到第三代时，形成较为均一的FCs。细胞呈梭形，增殖活跃。转染腺病毒的滑膜细胞，表达GFP；当腺病毒浓度为100 moi以上时，有100％的滑膜细胞感染。2 MTT法测定滑膜细胞抑制率：细胞只加入Ad-TK或GCV，生长未受抑制；100moi Ad-TK转染组细胞加入GCV后，细胞生长受抑制，并随GCV浓度增大细胞抑制率增大，当加入10 mg／l GCV后，细胞抑制率为76.0％。将细胞混合培养，加入10 mg／l GCV 48h后，当感染细胞占20％时，细胞抑制率为对照组的31.2％；细胞抑制率高于不混合时的抑制率。3滑膜细胞经HSV-TK／GCV系统作用后，倒置相差显微镜观察发现细胞由梭形转变为圆形，胞浆内出现空泡改变，细胞核变大；24h后细胞进一步肿胀变大，胞浆内空泡增多，细胞核变得模糊不清；48h后部分细胞裂解为碎片。HSV-TK／GCV系统处理的滑膜细胞，用Hoechst 33342／PI双染色后有3种细胞状态，分别为：正常细胞蓝色淡染，凋亡细胞为浓染或成颗粒状，坏死细胞为红色。4流式细胞仪检测转染TK基因并给予GCV后48 h，细胞出现较大比例的坏死和凋亡，坏死和凋亡比例分别为59.1％、13.4％，对照组无明显坏死和凋亡。结论1 OA滑膜细胞取材方便，易于体外培养、传代扩增；携带GFP的腺病毒载体可以高效感染体外培养的滑膜细胞。2 HSV-TK／GCV系统对体外OA滑膜细胞有抑制作用，在一定范围内GCV有浓度依赖性：HSV-TK／GCV系统对体外OA滑膜细胞存在“旁观者效应”。3细胞经HSV-TK／GCV系统作用后形态学发生变化：细胞变形、结构改变，最后死亡；双染色后荧光显微镜见细胞有坏死和凋亡。4流式细胞仪证实HSV-TK／GCV系统对体外OA滑膜细胞有明显抑制作用，坏死率高于凋亡率。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 实验一 OA滑膜细胞的分离、培养和含GFP的腺病毒载体在体外培养的OA滑膜细胞中表达的实验研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 实验二 HSV-TK/GCV系统对骨关节炎滑膜细胞的体外杀伤作用的实验研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 实验三 HSV-TK/GCV系统对骨关节炎滑膜细胞的作用的形态学观察和定量分析
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表