吴茱萸碱抑制HepG2细胞STAT3信号通路研究

论文摘要

在JAK2/STAT信号通路的激活促进了肿瘤细胞异常增殖、侵袭转移、血管生成并增强了肿瘤细胞的免疫逃避功能，在肿瘤的发生、发展及演进中发挥了举足轻重的作用。在多种肿瘤细胞（头部和颈部的鳞状细胞癌、乳腺癌、白血病／淋巴瘤、肺癌、肾细胞癌、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌和卵巢癌）中都发现了STAT3的持续激活，以JAK2/STAT3信号通路作为肿瘤分子治疗的靶点，筛选出能阻断肿瘤细胞中STAT3信号通路的药物对于预防和治疗肿瘤具有积极意义。吴茱萸碱吴茱萸碱是传统中药吴茱萸中的主要生物碱之一，具有抗炎、免疫调节等作用，此外很多研究表明吴茱萸碱还具有抗肿瘤活性。本项目采用蛋白免疫印迹技术（Western blot），细胞活力检测技术（MTT法），凝胶迁移实验（EMSA），RNA干扰，实时定量PCR，流式细胞检测技术等，从体外细胞实验研究吴茱萸碱对肝癌HepG2细胞中JAK2/STAT3信号通路的影响及其体外抗肝癌活性并通过建立HepG2细胞裸鼠移植瘤模型，从体内研究吴茱萸碱的抑瘤效果。本项目研究结果表明吴茱萸碱抑制了肝癌HepG2细胞中组成型及IL-6诱导型的STAT3的磷酸化，同时抑制了STAT3上游激酶JAK2、ERK1/2及Src的组成型激活，阻断了STAT3信号传导通路。酪氨酸磷酸酶抑制剂过钒酸钠逆转了吴茱萸碱对IL-6诱导的STAT3磷酸化的抑制作用，提示酪氨酸磷酸酶参与到了吴茱萸碱抑制STAT3磷酸化的过程中，进一步研究表明吴茱萸碱确实诱导了一种酪氨酸磷酸酶SHP-1的表达，RNA干扰技术抑制SHP-1蛋白的表达后逆转了吴茱萸碱对IL-6诱导的STAT3磷酸化的抑制作用。吴茱萸碱还上调了STAT3信号通路抑制因子SOCS-3的mRNA水平。STAT3的转录活力以及受STAT3调控的下游基因表达蛋白Bcl-2, Mcl-1, cyclin D1, HIF1-α, MMP-9, VEGF和survivin的水平均被吴茱萸碱所抑制。吴茱萸碱还抑制了HepG2细胞增殖，将细胞周期阻滞于G2/M期，并且诱导了肝癌HepG2细胞凋亡。吴茱萸碱对裸鼠HepG2异种移植瘤的体内研究表明，吴茱萸碱抑制了HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，且吴茱萸碱处理并未降低带瘤裸鼠的生存质量。本项目研究结果提示吴茱萸碱通过诱导酪氨酸磷酸酶SHP-1及STAT3信号通路抑制因子SOCS-3的表达升高，抑制STAT3上游激酶的活化，从而抑制了STAT3的活化，阻断JAK2/STAT3信号转导通路并抑制了STAT3通路下游调控基因的表达，最终诱导了HepG2细胞凋亡，并显示出体内抗肿瘤活性。提示吴茱萸碱是一种天然的抑制STAT3信号通路的抑制剂，具有开发成一种抗肝癌的天然药物。

论文目录

• 致谢
• 目录
• 英文缩写词
• 前言
• 第一章 绪论
• 1.1 JAK/STAT3 信号转导通路
• 1.1.1 JAK 家族
• 1.1.2 STAT3 家族
• 1.1.3 JAK2/STAT3 信号转导过程
• 1.2 JAK2/STAT3 信号通路与肝癌的关系
• 1.2.1 STAT3 在 HCC 中的表达
• 1.2.2 STAT3 与肝癌的转移
• 1.2.3 肝癌中的 STAT3 信号通路抑制剂研究进展
• 1.3 吴茱萸碱抗肿瘤作用研究进展
• 1.3.1 吴茱萸碱简介
• 1.3.2 吴茱萸碱抑制肿瘤细胞增殖，阻断细胞周期，诱导细胞凋亡
• 1.3.3 吴茱萸碱通过与凋亡诱导因子（ apoptosis inducing factor, AIF）相关的 caspase 非依赖途径诱导凋亡
• 1.3.4 吴茱萸碱诱导坏死及自噬
• 1.3.5 吴茱萸碱抑制肿瘤细胞浸润转移
• 第二章 吴茱萸碱抑制人肝癌 HEPG2 细胞株 STAT3 信号通路的机制研究
• 2.1 研究材料
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 实验试剂及配制
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 蛋白免疫印迹分析
• 2.2.2 凝胶迁移率实验
• 2.2.3 RT-PCR
• 2.2.4 Real-time qPCR
• 2.2.5 细胞转染
• 2.3 研究结果
• 2.3.1 吴茱萸碱抑制了组成型的及 IL-6 诱导的 STAT3 的磷酸化
• 2.3.2 吴茱萸碱展现出比 AG490 更强的抑制 STAT3 磷酸化的作用
• 2.3.3 吴茱萸碱上调了 SHP-1 及 SOCS-3 的 mRNA 水平
• 2.3.4 过钒酸钠逆转了吴茱萸碱对 IL-6 诱导的 STAT3 磷酸化的抑制作用
• 2.3.5 吴茱萸碱诱导了 HepG2 细胞中 SHP-1 的表达
• 2.3.6 RNA 干扰技术抑制 SHP-1 的蛋白表达逆转了吴茱萸碱对 IL-6 诱导的 STAT3 磷酸 化的抑制作用
• 2.3.7 吴茱萸碱抑制了 HepG2 细胞中组成型的 JAK2, Src 及 ERK1/2 的磷酸化
• 2.3.8 吴茱萸碱抑制了 HepG2 细胞中 STAT3 的 DNA 结合活力
• 2.3.9 吴茱萸碱下调了 HepG2 细胞中 STAT3 下游蛋白 Bcl-2, cyclin D1, Mcl-1,VEGF, survivin, XIAP, MMP-9 and HIF1-α 的水平
• 2.4 结论
• 第三章 吴茱萸碱抑制了肝癌细胞增殖，诱导了细胞周期阻滞并诱导了细胞凋亡
• 3.1 研究材料
• 3.1.1 细胞株
• 3.1.2 实验试剂及配制
• 3.1.3 实验仪器
• 3.2 研究方法
• 3.2.1 细胞活力检测
• 3.2.2 流式细胞技术
• 3.2.3 Hoechst33258 染色
• 3.2.4 蛋白免疫印迹分析
• 3.3 研究结果
• 3.3.1 吴茱萸碱引起 HepG2 细胞周期阻滞于 G2/M 期
• 3.3.2 吴茱萸碱诱导肝癌细胞凋亡
• 3.3.3 吴茱萸碱抑制了 HepG2 细胞活力，对正常肝细胞 LO-2 细胞活力则无明显的抑制作用
• 3.4 结论
• 第四章 吴茱萸碱体内抑瘤作用研究
• 4.1 研究材料
• 4.1.1 实验药品
• 4.1.2 实验动物
• 4.1.3 细胞株
• 4.2 研究方法
• 4.2.1 建立裸鼠异种移植瘤模型
• 4.2.2 给药
• 4.2.3 生理指标测定
• 4.2.4 数据分析处理
• 4.3 研究结果
• 4.3.1 吴茱萸碱体内抑制了 HepG2 细胞移植瘤的生长
• 4.4 结论
• 全文讨论
• 创新与不足之处
• 参考文献
• 摘要
• Abstract