小球藻锌结合类金属硫蛋白的提取及其功能研究

论文摘要

金属硫蛋白（metallothionein,MT）是一类分子量小、巯基含量高的蛋白质,具有抗氧化、抗肿瘤、调节机体平衡等功能。目前商品化的MT大多从兔肝提取,其技术难度大、生产成本高,故开发MT的原材料资源具有重要意义。研究发现微藻细胞含有类金属硫蛋白,且通过重金属胁迫可显著提高其含量。基于此,本论文通过Zn2+胁迫小球藻诱导产生类金属硫蛋白,经分离、纯化得到小球藻类金属硫蛋白,并且对其抑制酪氨酸酶、抗紫外辐射和抗镉损伤的功能进行试验。本学位论文由六章组成:第一章,介绍了金属硫蛋白的来源、结构、生理功能、检测方法与应用领域,并对微藻类金属硫蛋白的提取、结构表征和应用进行综述。第二章,通过不同浓度（5、10、20、50、100μmol/L）Zn2+胁迫培养小球藻,考察Zn2+胁迫下小球藻细胞的生理学响应机制。发现Zn2+胁迫将降低小球藻细胞的叶绿素含量,影响其抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT、POD）的活性,并促进其脂质过氧化,进而抑制小球藻细胞的生长。但Zn2+同时也具有促进小球藻Zn-MT-like蛋白生物合成的作用,当用50μmol/L Zn2+胁迫培养72 h,可使小球藻Zn-MT-like蛋白含量提高2.5倍以上。此外,通过差速离心法考察Zn在小球藻细胞的亚细胞分布,发现锌主要分布于热稳定蛋白（HSF）组分中,且其含量随Zn2+胁迫浓度的提高而增加,说明小球藻可通过HSF组分结合进入细胞内的锌,从而起到降低其损伤细胞的作用。第三章,小球藻经50μmol/L Zn2+胁迫培养72 h,离心收集藻细胞,经细胞破碎、离心后,提取小球藻蛋白质溶液。蛋白溶液分别经葡聚糖凝胶G-75、G-25层析柱分离、纯化后,经冷冻干燥得到小球藻Zn-MT-like蛋白制品,每克鲜藻可提取20 mg的小球藻类金属硫蛋白。经试验,发现该小球藻Zn-MT-like蛋白纯度为91.8%,且其分子量与MT相近。第四章,研究小球藻类金属硫蛋白对酪氨酸酶的抑制作用。发现小球藻Zn-MT-like蛋白具有延长单酚酶迟滞时间,并具有抑制单酚酶稳定态酶和二酚酶活性的作用,10mg/mL的小球藻Zn-MT-like蛋白可延长单酚酶迟滞时间至2300 s、几乎能完全抑制单酚酶稳定态酶的活性,且对二酚酶活性的抑制率高达87%。第五章,建立NIH/3T3细胞紫外辐射和镉损伤的模型,考察小球藻Zn-MT-like蛋白抗紫外辐射和抗镉损伤的作用。结果表明:小球藻Zn-MT-like蛋白具有较强的抗紫外辐射作用,10 mg/mL的小球藻Zn-MT-like蛋白可减少NIH/3T3细胞空泡、降低细胞裂解程度,使经辐射的NIH/3T3细胞活性从对照组的0.52增加到0.84。此外,发现小球藻Zn-MT-like蛋白具有抗镉损伤的作用,用10 mg/mL的小球藻Zn-MT-like蛋白处理NIH/3T3细胞,可显著降低其镉损失的程度。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第1章 前言
• 1.1 金属硫蛋白（MT）
• 1.1.1 MT的来源
• 1.1.2 MT的分子结构
• 1.1.3 MT与金属结合的特性
• 1.1.4 MT的生物学功能
• 1.1.5 MT的检测方法
• 1.1.6 MT的应用
• 1.2 微藻类金属硫蛋白
• 1.3 论文选题依据及研究路线
• 1.3.1 选题依据
• 1.3.2 研究内容
• 第2章 锌胁迫下小球藻细胞的生理学响应机制
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 仪器设备
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 小球藻培养方法
• 2.2.2 小球藻生物量的测定方法
• 2.2.3 小球藻的锌胁迫实验方法
• 2.2.4 小球藻细胞叶绿素含量的测定方法
• 2.2.5 小球藻细胞抗氧化酶活性的测定方法
• 2.2.6 小球藻细胞内丙二醛（MDA）含量的测定方法
• 2.2.7 锌在小球藻的亚细胞分布试验方法
• 2.2.8 小球藻细胞内锌结合蛋白的测定方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 小球藻细胞计数值与吸光度值的关系
• 2.3.2 锌胁迫对小球藻生长的影响
• 2.3.3 锌胁迫对小球藻叶绿素含量的影响
• 2.3.4 锌胁迫对小球藻抗氧化酶活性的影响
• 2.3.5 锌胁迫对小球藻细胞内MDA含量的影响
• 2.3.6 小球藻细胞内锌的亚细胞分布特征
• 2.3.7 锌胁迫对小球藻锌结合蛋白诱导量的影响
• 2.4 本章小结
• 第3章 小球藻类金属硫蛋白的分离纯化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要仪器设备
• 3.1.2 主要试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 小球藻类金属硫蛋白的提取
• 3.2.2 小球藻类金属硫蛋白的分离和纯化方法
• 3.2.3 小球藻类金属硫蛋白纯度的测定方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 小球藻类金属硫蛋白的制备
• 3.3.2 小球藻类金属硫蛋白的纯度测定结果
• 3.4 本章小结
• 第4章 小球藻类金属硫蛋白对酪氨酸酶的抑制作用
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 小球藻类金属硫蛋白对单酚酶的抑制实验
• 4.2.2 小球藻类金属硫蛋白对二酚酶的抑制实验
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 小球藻类金属硫蛋白对单酚酶的抑制作用
• 4.3.2 小球藻类金属硫蛋白对二酚酶的抑制作用
• 4.4 本章小结
• 第5章 小球藻类金属硫蛋白抗紫外辐射及抗镉损伤作用
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 主要试剂
• 5.1.2 主要仪器
• 5.1.3 试剂配制
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 NIH/3T3细胞培养方法
• 5.2.2 小球藻类金属硫蛋白对细胞生长的抑制实验
• 5.2.3 小球藻类金属硫蛋白的抗紫外辐射实验
• 5.2.4 小球藻类金属硫蛋白的抗镉损伤实验
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 小球藻类金属硫蛋白对NIH/3T3细胞生长的影响
• 5.3.2 紫外辐照对NIH/3T3细胞形态和增殖能力的影响
• 5.3.3 小球藻类金属硫蛋白对NIH/3T3细胞紫外辐射的保护作用
• 5.3.4 氯化镉对NIH/3T3细胞增殖能力的影响
• 5.3.5 小球藻类金属硫蛋白对细胞的抗镉损伤作用
• 5.4 本章小结
• 第6章 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.2 创新点
• 6.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的论文