Perilipin A调控慢性高剂量胰岛素和白细胞介素-6刺激的猪脂肪细胞脂肪分解及其分子机制

论文摘要

脂肪细胞中贮存的甘油三酯的水解是人和动物体内精细调节的动态平衡过程，与维持机体能量的动态平衡和代谢健康密切相关。Perilipin A是成熟脂肪细胞中脂滴膜上表达量较多的一种结构和功能蛋白，是多条脂解通路的终末靶点之一，对脂肪细胞的脂肪分解起着关键的调控作用。激素和细胞因子是影响脂肪细胞脂肪分解的重要因素，其中慢性高剂量胰岛素和白细胞介素（Interleukin，IL）-6均能够显著刺激人类及啮齿类动物脂肪细胞的脂肪分解，但在此过程中perilipinA的调控作用及其分子机制目前尚不清楚。猪的体脂沉积模式与啮齿类动物存在显著差异，却与人类更为接近，故可作为研究人类肥胖及相关疾病的理想动物模型。然而慢性高剂量胰岛素和IL-6对猪脂肪细胞脂肪分解的影响及其分子机制目前尚未见报导。本研究以1—7日龄仔猪为试验动物，采用胶原酶消化法获得原代猪前体脂肪细胞并诱导分化。用不同浓度的胰岛素和IL-6处理分化的猪脂肪细胞适当的时间，通过测定培养液中甘油和游离脂肪酸的释放量来检测脂解率；采用形态学观察检测脂肪细胞中甘油三酯积聚量的变化；Western Blot检测perilipin A的蛋白表达；RT-PCR检测Perilipin A、PPARγ2 （Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma2）、HSL （hormone sensitivelipase）、ATGL （adipose triglyceride lipase）、TNF-α（tumor necrosis factor-α）、IL-6、PGC-1α（peroxisome proliferators activated receptor gamma coactivator-1α）、CPT-1（carnitinepalmitoyl-transferase-1）和UCP2（uncoupling protein-2）等基因的mRNA表达；利用PKA（protein kinase A）、PKC（protein kinase C）脂解通路的抑制剂干预这两种因素刺激的脂肪分解，探讨所涉及的脂解通路及perilipinA在这一过程中的表达变化；利用罗格列酮（rosiglitazone）干预IL-6刺激的脂肪分解，研究perilipin A、PPARγ2、IL-6、PGC-1α、FAS（fatty acid synthase）等基因在这一过程中的表达变化，最后综合分析perilipin A调控慢性高剂量胰岛素和IL-6刺激的猪脂肪细胞脂肪分解的分子机制，取得以下主要结果：1．慢性高剂量胰岛素能够以时间和剂量依赖性的方式促进猪脂肪细胞的脂肪分解，同降低脂肪细胞对异丙肾上腺素刺激的脂解脂解应答能力；在这一过程中perilipin A和PPARγ的mRNA和蛋白表达水平显著下降，TNFα和IL-6的mRNA表达水平显著上调，而ATGL和HSL的mRNA表达水平无显著变化。2．PKA抑制剂H89和ERK（extracellular signal-related kinase）抑制剂PD98059、U0126均能够在一定程度上显著抑制慢性高剂量胰岛素刺激的脂肪分解；联合使用高剂量的PKA和ERK抑制剂几乎完全抑制了胰岛素刺激的脂肪分解；并且PD98059能够抑制胰岛素对perilipin A mRNA表达水平的下调作用，而H89却未表现出这种作用。3．IL-6受体系统基因IL-6R和gpl30在猪脂肪细胞中表达；慢性高剂量IL-6显著促进猪脂肪细胞的脂肪分解，同时使perilipin A和PPARγ2的mRNA和蛋白表达水平显著降低，但HSL的蛋白表达并未发生显著变化；另外脂肪酸氧化相关基因PGC-1α、CPT-1和UCP2的mRNA表达也显著升高。4．IL-6（100 ng／mL）不改变脂肪细胞内cAMP水平，PKA抑制剂H89对IL-6刺激的脂肪分解也没有显著影响；IL-6（100 ng／mL）显著促进脂肪细胞中ERKl／2的磷酸化，ERK抑制剂PD98059能够显著抑制IL-6刺激的脂肪分解，同时阻滞IL-6对perilipin AmRNA表达水平的下调作用。5．罗格列酮能够显著抑制IL-6刺激的脂肪分解，并增强IL-6预处理的脂肪细胞对异丙肾上腺素刺激的脂解应答；在这一过程中，perilipin A、PPARγ2、FAS和PGC-1α的基因表达显著上调，但IL-6的mRNA表达水平显著下调。综上所述，慢性高剂量胰岛素显著刺激猪脂肪细胞的脂肪分解，同时使perilipin A和PPARγ的mRNA和蛋白表达水平显著下调，并使TNFα和IL-6的mRNA表达水平显著上调。cAMP／PKA通路和MAPK／ERK通路同时参与了慢性高剂量胰岛素刺激的脂肪分解，但仅MAPK／ERK通路介导了perilipin A表达水平的下降。慢性高剂量IL-6通过抑制perilipin A、促进PGC-1α等基因的表达直接刺激猪脂肪细胞的脂肪分解。这一脂解过程主要由MAPK／ERK信号通路介导，而PKA介导的脂解通路并未参与。罗格列酮通过上调perilipinA和PGC-1α、下调IL-6的表达抑制IL-6刺激的脂肪分解。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 脂肪分解及其调控研究进展
• 1.1 脂肪代谢概述
• 1.1.1 脂肪的含义、分布及生理作用
• 1.1.2 脂肪的分解代谢
• 1.1.3 脂肪的合成代谢
• 1.2 脂肪酶与脂肪分解
• 1.2.1 激素敏感脂酶
• 1.2.2 脂肪甘油三酯脂酶
• 1.2.3 甘油三酯水解酶
• 1.3 脂肪分解的调节
• 1.3.1 激素调节
• 1.3.2 细胞因子调节
• 1.3.3 血糖调节
• 1.3.4 饮食调节
• 1.4 脂肪分解的信号机制
• 1.4.1 cAMP上调的机制
• 1.4.2 cAMP下调的机制
• 1.4.3 非依赖cAMP的机制
• 第二章 Perilipin A调控脂肪分解研究进展
• 2.1 脂滴包被蛋白
• 2.2 Perilin A的结构与功能
• 2.2.1 Perilipin的结构
• 2.2.2 Perilipin调控脂肪分解的功能
• 2.3 Perilipin调控脂肪分解的影响因素
• 2.4 Perilipin在肥胖个体脂肪组织中的表达
• 第三章 慢性高剂量胰岛素通过调控PERILIPIN A刺激猪脂肪细胞的脂肪分解
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验动物
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 实验仪器与器械
• 3.2.4 主要溶液配制
• 3.2.5 猪脂肪细胞的原代培养
• 3.2.6 培养液中甘油含量测定
• 3.2.7 培养液中游离脂肪酸含量测定
• 3.2.8 Western blot检测perilipinA和PPARγ的蛋白表达
• 3.2.9 RT-PCR检测脂解相关基因的mRNA表达
• 3.2.10 PerilipinA基因片段的分离、克隆和鉴定
• 3.2.11 数据分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 慢性高剂量胰岛素对猪脂肪细胞脂肪分解的影响
• 3.3.2 胰岛素对猪脂肪细胞中脂质积聚形态的影响
• 3.3.3 慢性高剂量胰岛素对异丙肾上腺素刺激的脂肪细胞脂解应答的影响
• 3.3.4 慢性高剂量胰岛素对猪脂肪细胞perilipinA和PPAR γ基因mRNA和蛋白表达的影响
• 3.3.5 Perilipin A 基因片段克隆
• 3.3.6 慢性高剂量胰岛素对HSL、ATGL、TNFα和IL-6基因mRNA表达的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 PERILIPIN A在慢性高剂量胰岛素激活的脂解通路中的作用机制
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验动物
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 实验仪器与器械
• 4.2.4 主要溶液配制
• 4.2.5 猪脂肪细胞原代培养
• 4.2.6 培养液中甘油含量测定
• 4.2.7 数据分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 PKA抑制剂对胰岛素刺激的猪脂肪细胞脂肪分解的影响
• 4.3.2 ERK抑制剂PD98059和U0126对胰岛素刺激的脂肪分解的影响
• 4.3.3 PKA和ERK抑制剂联合作用对胰岛素刺激的脂肪分解的影响
• 4.3.4 PKA抑制剂H89对胰岛素刺激的猪脂肪细胞perilipin A基因mRNA表达的影响
• 4.3.5 ERK抑制剂对胰岛素刺激的猪脂肪细胞perilipin A基因mRNA表达的影响
• 4.4 讨论
• 第五章 白细胞介素-6通过抑制PERILIPIN A和促进PGC-1A表达刺激猪脂肪细胞脂肪分解
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试验动物
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 实验仪器与器械
• 5.2.4 主要溶液配制
• 5.2.5 猪脂肪细胞原代培养
• 5.2.6 培养液中甘油含量测定
• 5.2.7 Western blot检测perilipinA、PPARγ和HSL的蛋白表达
• 5.2.8 RT-PCR检测脂肪分解相关基因的mRNA表达
• 5.2.9 数据分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 IL-6对猪脂肪细胞脂肪分解的影响
• 5.3.2 猪脂肪细胞中IL-6R和gp130基因的鉴定
• 5.3.3 IL-6对猪脂肪细胞中脂质积聚形态的影响
• 5.3.4 IL-6对perilipin A、PPARγ2和HSL的mRNA和蛋白表达的影响
• 5.3.5 IL-6对脂肪酸氧化相关基因表达的影响
• 5.4讨论
• 第六章 PERILIPIN A通过MEK/ERK脂解通路调控IL-6刺激的脂肪分解
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 试验动物
• 6.2.2 主要试剂
• 6.2.3 实验仪器与器械
• 6.2.4 主要溶液配制
• 6.2.5 猪脂肪细胞原代培养
• 6.2.6 培养液中甘油含量测定
• 6.2.7 细胞内cAMP含量测定
• 6.2.8 Western blot分析
• 6.2.9 RT-PCR分析
• 6.2.10 数据分析
• 6.3 结果
• 6.3.1 PKA抑制剂对IL-6刺激的脂肪分解的影响
• 6.3.2 IL-6对脂肪细胞内cAMP含量的影响
• 6.3.3 IL-6对猪脂肪细胞ERK磷酸化的影响
• 6.3.4 ERK抑制剂PD98059和U0126对IL.6刺激的脂肪分解的影响
• 6.3.5 ERK抑制剂PD98059对IL-6刺激的猪脂肪细胞perilipin A基因表达的影响
• 6.4 讨论
• 第七章 罗格列酮通过上调PERILIPIN A表达抑制IL-6刺激的脂肪分解
• 7.1 引言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 试验动物
• 7.2.2 主要试剂
• 7.2.3 实验仪器与器械
• 7.2.4 主要溶液配制
• 7.2.5 猪脂肪细胞原代培养
• 7.2.6 培养液中甘油含量测定
• 7.2.7 Perilipin A蛋白表达分析
• 7.2.8 脂肪代谢相关基因的mRNA表达分析
• 7.2.9 数据分析
• 7.3 结果
• 7.3.1 罗格列酮对慢性高剂量IL-6刺激的猪脂肪细胞脂肪分解的影响
• 7.3.2 罗格列酮对慢性高剂量IL-6刺激的猪脂肪细胞脂质积聚形态的影响
• 7.3.3 罗格列酮对慢性高剂量IL-6刺激的猪脂肪细胞perilipin A蛋白表达的影响
• 7.3.4 罗格列酮对慢性高剂量IL-6刺激的猪脂肪细胞中脂肪代谢相关基因表达的影响
• 7.4 讨论
• 结论
• 创新点
• 进一步研究的内容
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
• 作者简介