论文摘要
调节性T细胞在调节免疫耐受和免疫反应中起着重要的作用。调节性T细胞通过抑制自身反应性T细胞的活化和扩增,得以限制变态反应疾病、感染、移植、移植物抗宿主反应和癌症中的免疫反应强度,达到调节免疫应答的目的。肝脏是人体最大的实质器官,是体内物质代谢和解毒的重要场所。肝脏内的免疫系统持续接触从肠道来源的食物抗原及微生物。因此,肝脏内的免疫和耐受需要处于一种动态平衡。肝炎是世界性范围内的一种重大疾病。调节性T细胞在外周耐受中起关键作用。然而,调节性T细胞是否参与了维持肝脏内生理状态以及控制病理免疫反应还不清楚。目前,关于调节性T细胞在肝脏内生理以及病理免疫反应中作用的报道十分有限。刀豆蛋白A（concanavalin A,Con A）诱导肝炎是一种已经建立好的急性肝炎的动物模型,主要通过快速活化多克隆T细胞（主要为CD4+T细胞和NKT细胞）来实现自身免疫损伤。Con A诱导的肝炎其特征是血清转氨酶水平迅速升高,血清中含有大量细胞因子,肝脏出现白细胞浸润,肝细胞坏死和凋亡。这种由ConA诱导的免疫系统过度活化所引起的肝脏急性损伤可以在短时间内自我恢复。在Con A诱导的肝炎模型中,影响免疫系统自我调控能力的机制仍不清楚。本研究的目的,是探讨在这种免疫介导肝脏损伤模型中的调节因素。1.调节性T细胞通过TGF-β抑制T细胞介导的肝炎在本研究中,我们使用Con A诱导的肝炎模型作为平台,研究肝脏内调节性T细胞在肝脏损伤中的作用。我们通过给小鼠注射Con A来建立Con A诱导肝脏损伤的模型。通过对小鼠血清转氨酶的检测以及组织病理学的观察,确定肝脏损伤情况。通过流式细胞计数仪,检测肝脏以及脾脏内调节性T细胞的比例变化情况,并对调节性T细胞进行绝对数量的计数。通过流式细胞术,我们还对肝脏内的调节性T细胞进行表型分析。我们通过系统性清除调节性T细胞以及将调节性T细胞过继转输到受体鼠体内的实验,研究调节性T细胞在Con A模型中的作用。为了研究调节性T细胞在Con A模型中发挥作用的机理,我们用ELISA的方法检测了小鼠血清中细胞因子的水平,并且通过实时定量PCR实验检测了肝脏内细胞因子的水平。最后,为了在体外实验模型中确认调节性T细胞在ConA模型中的作用,我们使用了4小时谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）释放法检测了肝脏内淋巴细胞对肝细胞的细胞毒作用。结果显示,肝脏损伤的恢复需要调节性T细胞的存在。Con A注射可以在早期诱导出一群调节性T细胞。ConA处理伴随着肝脏内Foxp3+调节性T细胞比例及绝对数目的显著增加,这种增加在Con A诱导的肝脏损伤过程中持续存在。脾脏内的调节性T细胞并没有明显的变化。对细胞进行胞内转录因子Foxp3荧光染色的实验表明,在经过Con A处理的小鼠中,其肝脏中CD4+T细胞Foxp3的表达水平明显升高,而脾脏中的Foxp3表达水平没有明显变化。除了Foxp3分子外,调节性T细胞上细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）、糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体（GITR）,以及CD103分子的表达都有所上升,而CD45RB和CD62L的表达变化不明显。我们通过使用抗-CD25的单克隆抗体（克隆号:PC61.5.3）来系统性清除小鼠体内的调节性T细胞,以便在体内研究调节性T细胞在Con A模型中的相关功能。经过抗-CD25单克隆抗体处理的小鼠,肝脏内表达Foxp3的CD4+T细胞数量明显降低,这说明小鼠体内的调节性T细胞可以被该抗体所清除。清除CD25+细胞加重Con A诱导的肝炎。经过抗-CD25抗体处理的小鼠与经过对照抗体处理的小鼠相比,由Con A所诱导的血清ALT水平的升高更为明显,肝脏的坏死程度也明显加重。与之对应的,我们纯化了肝脏的CD25+单个核细胞,用于继转输实验。过继转输肝脏CD25+单个核细胞可以减轻由Con A引起的肝脏损伤。与转输了未经处理的肝脏单个核细胞的对照小鼠相比,转输了肝脏CD25+单个核细胞的受体小鼠中,由Con A所引起的血清ALT水平的升高明显受到抑制,并且其肝脏中只显示出轻微损伤。最后,我们研究了调节性T细胞在Con A模型中发挥作用的机理。在Con A处理的小鼠中,血清中TGF-β1含量以及肝脏单个核细胞中TGF-β1 mRNA的表达都明显上升;清除小鼠体内的调节性T细胞可以抑制这种由Con A引起的TGF-β1的升高。相比而言,清除小鼠体内的调节性T细胞并不能降低Con A处理小鼠血清及肝脏内IL-10的水平。除此之外,在体外实验中,Con A处理过的肝脏单个核细胞对小鼠的原代肝细胞有明显的细胞毒作用;通过在培养体系中加入经过Con A处理的肝脏CD25+单个核细胞,可以抑制这种细胞毒活性;肝脏CD25+单个核细胞的这种抑制作用,可以通过加入抗-TGF-β单克隆抗体,中和培养体系中的TGF-β1来阻断。2.IL-2对免疫性肝炎的调节作用由于CD4+CD25+调节性T细胞表面组成性表达IL-2Rα（CD25）,以及对IL-2的应答特性,我们比较了各种T细胞（主要常规T细胞和调节性T细胞）对IL-2的应答能力和相互关系。我们通过不同的注射策略,用白细胞介素-2（interleukin 2,IL-2）对小鼠进行预处理,研究IL-2在Con A模型中的调节作用。IL-2的注射策略分为两种:一次性高剂量IL-2（2500单位每克体重）注射和多次低剂量IL-2（500单位每克体重,4次）注射。我们通过这两种策略给小鼠预先注射IL-2,然后在小鼠上建立Con A诱导肝炎模型。我们检测了这两个实验体系中,IL-2的处理对Con A诱导的肝脏损伤的影响。一次性高剂量IL-2预注射可以减轻由Con A引起的肝脏损伤。高剂量IL-2预注射可以使受到致死剂量Con A注射的小鼠免于死亡。在亚致死剂量Con A注射时,高剂量IL-2预注射使小鼠血清转氨酶水平比对照小鼠显著降低,肝脏损伤也较轻。高剂量IL-2可以减少Con A注射后肝脏对T细胞的招募,并且降低T细胞上CD122和CD25的表达,而对Fas的表达没有影响。这提示了高剂量IL-2可以负调节自身应答性效应T细胞活化,但并不通过AICD导致效应T细胞凋亡。一次性高剂量IL-2注射对CD4+CD25+T细胞的数量和表面CTLA-4、CD103、CD45RB和CD62L的表达影响不大,提示一次性高剂量IL-2预注射对肝脏的保护作用与调节性T细胞关系不大。此外,高剂量IL-2处理可以提高Con A模型中起保护作用的细胞因子IL-6和IL-10的表达水平,并且降低造成肝脏损伤的细胞因子TNF-α的表达。多次低剂量IL-2预注射可以加重由Con A引起的肝脏损伤。低剂量IL-2注射会导致由Con A引起的小鼠血清ALT水平增高更为显著,并且造成三分之一的小鼠死亡。低剂量IL-2注射可以诱导肝脏和脾脏中CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量和比例增加。同时,和单纯Con A注射的小鼠相比,低剂量IL-2注射可以使Con A模型中的肝脏和脾脏中CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量和比例增加更为显著。这群具有调节性T细胞表型的细胞是否具有负调节功能或者这群细胞是否直接具有类似效应T细胞的功能有待进一步研究。综上所述,我们的实验结果显示Con A的处理伴随着调节性T细胞的显著增多,调节性T细胞在Con A诱导的肝炎中对控制肝脏损伤起了重要的作用。调节性T细胞通过TGF-β依赖的机制行使其抑制功能。本研究证明了在T细胞依赖的免疫介导的肝脏损伤中,调节性T细胞起着重要的抑制作用,这为肝脏免疫学、肝炎的临床治疗以及药物开发提供了有价值的理论依据。不同的IL-2预处理策略在ConA模型中具有截然不同的效果。研究IL-2不同处理方式对免疫诱导肝炎的影响,可以为制订免疫性肝炎的治疗策略提供理论依据。