论文摘要
目的:（1）建立简便、易行的新生大鼠海马神经干细胞（NSC）的分离培养和扩增的方法,并鉴定神经干细胞;（2）探讨神经干细胞在体内外增殖、分化的特点,并从局部微环境角度来探讨神经干细胞的发生与分化机制,为细胞体内移植研究奠定基础。方法:（1）从新生大鼠海马中分离NSC,采用NSC克隆悬浮法,选用DMEM/F12培养液,添加无血清培养添加剂B27,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及表皮细胞生长因子（EGF）进行体外扩增培养,机械和胰酶消化的方法分离连续传代培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,并采用免疫细胞化学法检测NSC标志物Nestin的表达及分化后细胞神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和2,3-环核甘酸磷酸二脂酶（CNP）的表达;（2）观察20ng/ml浓度下的bFGF、EGF对NSC增殖的影响,用免疫荧光染色和流式细胞仪分选细胞法观察bFGF,EGF对神经干细胞分化为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的影响;（3）采用化学法、差速贴壁法和振荡法分离纯化星型胶质细胞,用免疫细胞化学染色法,GFAP标记星型胶质细胞,进行细胞纯度的鉴定;将星型胶质细胞接种在6孔培养板中,待细胞均匀长满后,换神经干细胞基础培养液,置于培养箱孵育24h,将涂有PLL的盖玻片放入6孔板中,将神经干细胞球种到盖玻片上,在互不接触的情况共培养,每2d更换一次培养基,免疫细胞化学染色法观察星型胶质细胞源性因子对神经干细胞分化后NSE、GFAP和酪氨酸羟化酶（TH）表达的影响。结果:（1）从新生大鼠海马分离的细胞在含有生长因子bFGF或EGF的无血清的神经干细胞基础培养液中,能形成大量悬浮的神经干细胞球,流式细胞仪的结果表明这些干细胞球可在体外扩增及传代培养,经免疫细胞化学鉴定,Nestin抗体标记阳性,分化后的细胞表达神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的特异性抗原;（2）免疫荧光染色和流式细胞仪分选细胞显示bFGF能明显增加NSE的表达（P＜0.05）,EGF能明显增加GFAP的表达（P＜0.05）;（3）纯化的星型胶质细胞经免疫细胞化学鉴定,GFAP抗体标记阳性,细胞纯度达98%;（4）星型胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞贴壁分化加快,经免疫组化染色鉴定,NSE阳性细胞及TH阳性细胞明显多于对照组（P＜0.05）。结论:（1）能够从新生大鼠的海马中分离出具有能自我更新、具有增殖能力和多分化潜能,表达Nestin蛋白的干细胞,该类细胞属于中枢神经系统的干细胞,该方法简便易行,是进行诱导分化的良好细胞模型;（2）bFGF诱导NSC更多向神经元分化,EGF则诱导NSC更多向胶质细胞分化;（3）星型胶质细胞能诱导神经干细胞向神经元,包括多巴胺神经元分化,这一神经发生通路从一个新的角度阐明神经发育机制,也提供了一个快速而有效获得大量神经元的方法。