利用表面等离子共振生物传感器检测玉米褪绿斑驳病毒和Cry1F蛋白的研究

论文摘要

随着全球化贸易的发展以及转基因技术的应用，我国近年来在玉米相关领域的国际贸易越来越频繁，导致玉米褪绿斑驳病毒等检疫性有害生物以及转基因蛋白随玉米种子传入的风险也越来越大。因此如何简便快捷地检测出进口玉米中的检疫性病毒以及其他产品中的转基因蛋白具有重要的意义。本课题利用SPR生物传感器，对玉米褪绿斑驳病毒和转基因抗虫蛋白cry1F的检测进行了研究。本课题包括三个部分。首先以健康玉米叶为原材料，对玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）进行了繁殖和纯化，然后经小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选与克隆以及腹水抗体制备与纯化过程获得了纯化的玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体，并对其进行了效价测定、亚类鉴定、特异性分析以及灵敏度研究。然后，基于表面等离子共振生物传感器检测方法，对纯化的玉米褪绿斑驳病毒的检测进行了研究。优化了相关检测条件，对病毒检测的灵敏度和特异性进行了研究；并且在优化条件下对携带玉米褪绿斑驳病毒的实际玉米样品的检测进行了研究。最后，利用SPR生物传感器对Bt抗虫蛋白cry1F的检测进行了研究。主要研究成果如下：（1）获得了纯化的玉米褪绿斑驳病毒，浓度为10mg/mL。获得了1株命名为1C5能稳定分泌抗MCMV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，效价为1×106，IgG1亚类，经G蛋白柱纯化的单克隆抗体的浓度为0.46mg/mL。该单抗特异性很好，能检测携带玉米褪绿斑驳病毒的玉米病汁液的最大稀释倍数为6400倍。（2）建立了检测MCMV的SPR方法。确立了检测MCMV的最优条件：SPR芯片抗体固定时间3h、抗体固定浓度200μ g/mL、抗体固定温度37℃、抗体固定pH6、进样流速10μ l/min、检测温度20℃、检测pH7.4。该检测方法具有很好的特异性，重复性较好，最低检测限为1ng/mL，并且能够检测实际带病玉米样品，检测时间15min。（3）建立了检测cry1F蛋白的SPR方法，进行的特异性和灵敏度实验表明该方法具有很好的特异性，重复性好，检测灵敏度为10ng/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 基于表面等离子共振的传感技术
• 1.2.1 表面等离子共振的基本原理
• 1.2.2 表面等离子共振传感器简介
• 1.2.3 SPR传感器的相关工作原理
• 1.2.4 SPR传感器的表面修饰机理
• 1.2.5 SPR传感器检测的基本原理和主要模式
• 1.3 SPR传感器应用于分析检测的研究进展
• 1.3.1 SPR传感器应用于病原体检测的研究
• 1.3.2 SPR传感器应用于毒素检测的研究
• 1.3.3 SPR传感器应用于蛋白质检测的研究
• 1.3.4 SPR传感器应用于识别病毒病原体的抗体的研究
• 1.3.5 SPR传感器应用于环境监测的研究
• 1.3.5.1 杀虫剂
• 1.3.5.2 2,4,6-三硝基甲苯（TNT）
• 1.3.5.3 多环芳烃（Aromatic Hydrocarbons）
• 1.3.5.4 重金属（Heavy Metals）
• 1.3.5.5 酚类（Phenols）
• 1.3.5.6 多氯联苯（Polychlorinated Biphenyls）
• 1.3.5.7 二噁英（Dioxins）
• 1.4 玉米褪绿斑驳病毒简介
• 1.5 cry1F蛋白简介
• 1.6 研究内容以及拟解决的关键问题
• 1.6.1 研究内容
• 1.6.2 拟解决的关键性问题
• 第二章、玉米褪绿斑驳病毒纯化及其单克隆抗体制备的研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 动植材料
• 2.1.2 病毒材料
• 2.1.3 其他耗材和试剂
• 2.1.4 仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验中所使用溶液的配制方法
• 2.2.2 病毒繁殖与纯化（玉米褪绿斑驳病毒制剂的制备）
• 2.2.3 小鼠免疫
• 2.2.4 细胞融合
• 2.2.4.1 SP2/0骨髓瘤细胞的制备过程
• 2.2.4.2 免疫脾细胞的制备过程
• 2.2.4.3 饲养细胞的制备过程
• 2.2.4.4 细胞融合
• 2.2.5 杂交瘤细胞的筛选和克隆过程
• 2.2.6 腹水抗体的制备和纯化过程
• 2.2.7 腹水抗体的特异性和其效价的测定
• 2.2.8 单抗灵敏度的测定过程
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 纯化病毒的浓度测定
• 2.3.2 杂交瘤细胞的筛选与腹水抗体效价的测定结果
• 2.3.3 单克隆抗体的类型与亚类鉴定的结果
• 2.3.4 单克隆抗体的特异性测定结果
• 2.3.6 腹水单克隆抗体检测的灵敏度分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 利用表面等离子共振传感器检测玉米褪绿斑驳病毒的研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 其他材料和试剂
• 3.1.3 仪器和设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 实验中所使用溶液的配制方法
• 3.2.2 SPR镀金玻片预处理
• 3.2.3 SPR镀金玻片修饰上单抗过程
• 3.2.4 SPR检测病毒样品的过程
• 3.2.5 实际样品的 SPR检测过程
• 3.2.6 ELISA验证实验过程
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 ELISA实验结果
• 3.3.2 单抗固定条件对病毒检测影响的研究
• 3.3.2.1 单抗固定时间对病毒检测过程的影响分析
• 3.3.2.2 单抗固定浓度对病毒检测过程的影响分析
• 3.3.2.3 单抗固定温度对病毒检测过程的影响分析
• 3.3.2.4 单抗固定pH对病毒检测过程的影响分析
• 3.3.3 SPR实验检测条件对病毒检测影响的研究
• 3.3.3.1 进样流速对病毒检测影响的研究
• 3.3.3.2 温度的影响
• 3.3.3.3 pH的影响
• 3.3.4 SPR检测MCMV灵敏度及重复性的研究
• 3.3.5 SPR检测MCMV的特异性
• 3.3.6 实际带病玉米样品的 SPR检测
• 3.4 本章小结
• 第四章 利用表面等离子共振传感器检测Cry1F蛋白的研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验用蛋白及其抗体
• 4.1.2 其他材料和试剂
• 4.1.3 仪器和设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 实验中所使用溶液的配制方法
• 4.2.2 SPR金片片预处理
• 4.2.3 SPR金片修饰抗体过程
• 4.2.4 样品的 SPR检测过程
• 4.2.5 ELISA 实验验证过程
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 ELISA 实验结果
• 4.3.2 SPR检测cry1F蛋白的灵敏度
• 4.3.3 SPR检测cry1F蛋白的重复性
• 4.3.4 SPR检测cry1F蛋白的特异性
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 5.3 下一步工作建议
• 参考文献
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者和导师简介
• 硕士研究生学位论文答辩委员会决议书