人羧肽酶A1、抗精浆单链抗体/人羧肽酶A1融合蛋白的表达及活性测定

论文摘要

前列腺癌是老年男性最常见恶性肿瘤之一。在美国,2009年新增192,280个前列腺癌患者,占男性新发肿瘤的四分之一。随着前列腺癌检出率的提高、人口老龄化及生活习惯的改变,我国前列腺癌发病率逐年增加,已成为中国男性最为常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在男性癌症死亡率中仅次于膀胱癌和肾癌。中国民众和中国政府越来越关注前列腺癌的预防,早期发现,早期诊断以及早期治疗等研究。目前,前列腺癌的治疗主要包括手术治疗、内分泌治疗、放疗、化疗和生物疗法等。但所有这些治疗手段都存在其自身局限性。因此,寻找新的治疗前列腺癌的方法具有十分重要的意义。1987年提出的ADEPT是一种使化疗药物局限在肿瘤组织内活化的治疗方案,可以增强药物对肿瘤细胞的杀伤效率,降低对正常组织的毒性作用。达到该目标需具备三个步骤:首先应用针对肿瘤抗原的特异性抗体作为载体,携带前体药物的专一性活化酶;第二步,血循环中的抗体-酶复合物（antibody-enzyme complex, AEC）需完全清除,只局限于肿瘤部位;第三步,由静脉给药的未活化的前体药物可以区域特异性地在肿瘤组织内被抗体所携带的酶转化为活性细胞毒分子,发挥对肿瘤细胞的杀伤作用。本实验室应用CPA1针对前列腺癌的ADEPT疗法的研究已取得一定的研究进展。首次合成了前体药物氨甲喋呤-α-苯丙氨酸（MTX-α-Phe）和氨甲喋呤-α-精氨酸（MTX-α-Arg）;体外细胞毒试验表明,MTX-α-Phe经CPA1水解转化为MTX,其细胞毒活性大于前体药物100倍以上。用抗人精浆蛋白单克隆抗体-CPA交联物（E4B7McAb-CPA）进行前列腺癌动物模型的体内试验,抑瘤率达87.6%,显示了良好的应用前景。本研究组已制备了CPA1全酶、活性中心等各肽段融合蛋白,研究中我们发现CPA1基因序列较长,与抗精浆蛋白单链抗体构建成融合基因后,由于分子量较大,表达效率低,较难得到具有活性且具备一定量的融合蛋白。而活性中心的分子量较小,约为25KD左右,但活性约为全酶的一半。通过生物信息学分析,发现活性中心N-端有一段β-片层结构,C-端有一段α-螺旋结构,遮蔽了活性中心的关键位点,使活性中心的底物结合位点无法完全暴露,推测这两个结构域可能会使活性中心的活性降低。为此,我们设计克隆了去除活性中心N-端65bp和C-端67bp碱基的活性短片段基因。首先进行活性中心、活性短片段的体外原核表达,经诱导表达分别得到了分子量约25KD和20KD的目的蛋白,进一步用Western blot证实了目的蛋白的成功表达;应用Hippuryl-L-Phenylalanine法、MTT法和细胞凋亡实验进行酶活性的检测,研究结果发现hCPA1活性短片段具有与活性中心相当的活性,但并未如预期的有所增强。推测原因,可能是包涵体变性复性过程所致。为此我们更换表达载体,应用真核表达载体,转染PC-3细胞,表达目的蛋白;RT-PCR、细胞免疫荧光法检测目的蛋白的表达;最后分别用MTT法和细胞凋亡测定表达产物水解酶活性。对表达产物的水解活性测定显示:活性短片段和活性中心均具有部分水解活性,且活性短片段的活性要稍高于活性中心;但与scFv连接后在一定程度上影响其水解活性。我们推测,在实验过程中我们是应用overlap-PCR将scFv的VL直接与酶进行连接,两者可能在一定程度上相互影响自身的结构折叠,而影响了酶的活性。此推测有待于进一步验证。目前,尚不清楚具有一定酶活性的hCPA1活性短片段是否会由于渗透性的增强而大量活化前体药物MTX-α-Phe,从而具有较全长hCPA1更好的对实体瘤的杀伤效率。该hCPA1活性短片段的获得,为抗人精浆蛋白单链抗体/hCPAl融合蛋白系统的进一步优化和用于前列腺癌的治疗奠定基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 一、前列腺癌治疗现状
• 二、肿瘤的抗体导向酶-前体药物疗法
• 1 ADEPT 系统的组成
• 2 ADEPT 系统的给药方法
• 3 ADEPT 研究进展
• 4 常见的活化前体药物酶
• 三、羧肽酶A 的结构
• 四、羧肽酶的催化水解机制
• 五、未来发展与展望
• 正文
• 实验一 羧肽酶A1 活性中心、活性短片段的表达及活性分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 抗精浆蛋白单链抗体/羧肽酶A1 及其肽段融合蛋白的克隆及原核表达
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 羧肽酶 A1 活性中心、活性短片段、scFv/羧肽酶 A1 及其活性肽段融合蛋白真核表达及活性分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢