论文摘要
目的:1.建立大鼠糖尿病性白内障动物模型,探讨糖尿病大鼠晶状体混浊的发生机制。2.探讨谷胱甘肽乙酯滴眼液（glutathione ethyl ester,GSH-EE）对链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）诱导的大鼠糖尿病性白内障的作用及其机制。3.初步探讨肌肽（carnosine,Car）对高浓度葡萄糖（high glucose,HG）诱导人晶状体上皮细胞凋亡的作用及其机制。方法:对66只大鼠行裂隙灯检查,排除晶状体病变。随机抽取10只大鼠作为正常对照组（A组）,腹腔注射0.02 mol/L枸橼酸缓冲液（65 mg/kg,pH 4.5）。56只大鼠完全随机分为谷胱甘肽乙酯治疗组（B组）和糖尿病未治疗组（C组）,腹腔注射1%链脲佐菌素（65 mg/kg）枸橼酸缓冲液,血糖>14 mmol/L的大鼠作为糖尿病大鼠,注射STZ前5d正常组和糖尿病未治疗组给予25 mmol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.4）、治疗组大鼠给予0.1%谷胱甘肽乙酯磷酸钠缓冲液,滴双眼,2/d。每4wk监测大鼠血糖,每周监测大鼠尿糖和体重的变化。通过裂隙灯观察并记录大鼠晶状体混浊的进展。晶状体混浊分级标准采用英国牛津大学眼科实验室方法。4、8、13wk时处死大鼠,取出晶状体,测定其中水溶性蛋白质、谷胱甘肽（glutathione,GSH）和糖基化终产物含量（advanced glycation end products,AGEs）以及谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase,GR）、过氧化氢酶（catalase,CAT）活性。在高糖诱导人晶状体细胞凋亡的基础上,加入不同浓度的肌肽作用于细胞,采用MTT比色法确定高糖和肌肽作用浓度。晶状体上皮细胞分为三组,并在体外培养:正常组（DMEM）、高糖组（DMEM+120 mmol/L高糖）,肌肽治疗组（DMEM+120 mmol/L高糖+25 mmo1/L肌肽）。高糖孵育24、48、72、96h时分别取各组晶状体上皮细胞裂解上清液,用分光光度法测定测定晶状体上皮细胞中的凋亡相关酶Caspase-3的活性变化。同时在光学显微镜利用细胞凋亡原位法（TUNEL）检测凋亡的晶体上皮细胞,并计算上皮细胞凋亡率。结果:1.注射链脲佐菌素后72 h,糖尿病大鼠血糖（C组29.43±5.23 mmol/L）较正常大鼠血糖（A组6.99±0.42 mmol/L）显著升高（P<0.05）,在实验各个时间点,糖尿病大鼠始终保持高血糖和较低体重。2.糖尿病未治疗组大鼠链脲佐菌素注射后第3 wk晶状体开始出现混浊,其混浊表现为两阶段进展,链脲佐菌素注射后第3～6 wk晶状体混浊进展缓慢,第7～13 wk晶状体混浊进展迅速。3.谷胱甘肽乙酯治疗组大鼠链脲佐菌素注射后第4 wk晶状体开始出现混浊,第4 wk时谷胱甘肽乙酯治疗组大鼠晶状体混浊程度显著低于糖尿病未治疗组,差异有统计学意义（P<0.05）;在注射STZ后5wk,各糖尿病组的晶状体混浊程度明显加重,并且各组之间进展程度没有明显差异。4.以正常组大鼠为标准,糖尿病治疗组大鼠晶状体中GSH含量及CAT,GR活性显著下降（P<0.05）。注射链脲佐菌素后第4、8 wk,谷胱甘肽乙酯治疗组与糖尿病未治疗组大鼠晶状体中谷胱甘肽的含量（mg/gprot,4 wk: 80.32±10.02 vs 68.44±9.05;8 wk: 56.62±9.82vs 50.27±8.43）相比,分别增加了17.5%和12.6%,但无统计学差异（P>0.05）。各个时间点,谷胱甘肽乙酯治疗组与糖尿病未治疗组大鼠晶状体中过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶和糖基化终产物比较,差异无统计学意义。这提示谷胱甘肽乙酯可以抑制晶状体中GSH含量下降。5.肌肽对高糖诱导人晶状体上皮细胞系SRA01-04的存活率有显著的提高作用,选取晶状体上皮细胞的存活率为50%时肌肽浓度（25 mmol /L）作为实验药物浓度。6. 25 mmo1/ L的肌肽作用于人晶状体上皮细胞可降低其Caspase-3活性。高糖孵育48、72、96 h后肌肽治疗组Caspase-3活性分别比高糖组低11%（P>0.05）、22% （P<0. 05）和8%（P>0.05）。7. TUNEL检测结果显示肌肽可抑制晶状体上皮细胞凋亡率。晶状体上皮细胞凋亡率随高糖孵育时间延长而增高。高糖孵育48、72、96 h后肌肽治疗组晶状体上皮细胞凋亡率分别比高糖组低4%（P>0.05）、13%（P<0. 05）和5%（P>0.05）。结论:1.链脲佐菌素大鼠是研究糖尿病性白内障的理想模型,本实验显示注射链脲佐菌素后4 wk,大鼠晶状体已经出现白内障早期特征性改变。2.谷胱甘肽乙酯滴眼液局部应用对糖尿病大鼠是安全的,它能抑制早期糖尿病性白内障的进展,但到了中晚期糖尿病,谷胱甘肽乙酯的这种作用就逐渐减弱,推测其作为合成谷胱甘肽的前体,保护巯基氧化,进而维持晶状体透明及其功能。3.高糖可通过Caspase-3的活化,使晶状体上皮细胞发生凋亡。肌肽可以抑制高糖诱导的人晶状体上皮细胞增殖率的下降,Caspase-3酶活性升高和人晶状体上皮细胞凋亡。创新点:1.首次把GSH-EE滴眼液用于糖尿病性白内障的实验研究,避免了重复腹腔注射引起的多发感染等全身副反应,也简化了操作,滴眼液比腹腔注射更适用于眼科临床。2.对糖尿病大鼠晶状体的抗氧化体系和糖基化终产物进行了动态检测,有利于了解糖尿病性白内障发展过程的各种生物学指标,明确药物的作用时间,并为我们进行下一步实验做好基础。
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