抗菌肽hCAP-18/LL-37基因转染对巨噬细胞RAW264.7活化功能的影响

论文摘要

采用分子生物学与免疫学技术,研究人源阳离子抗菌肽hCAP-18/LL-37基因转染对M1型巨噬细胞RAW264.7细胞活化功能的影响及其机理。采用脂质体转染的方法将本实验室已构建的重组质粒pcDNA4/Myc-His-LL-37瞬时转染至RAW264.7细胞,RT-PCR法检测其转染情况;MTT法检测RAW264.7细胞的增殖活性;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡变化;中性红吞噬实验检测RAW264.7吞噬功能;RT-PCR法分析CD80、CD86与TLR及细胞因子的mRNA的表达。结果表明:hCAP-18/LL-37基因成功转染RAW264.7细胞;hCAP-18/LL-37基因转染可促进LPS处理的RAW264.7细胞的增殖活性;hCAP-18/LL-37基因转染后RAW264.7细胞未出现明显的凋亡和细胞周期的改变;中性红吞噬实验结果表明: LPS处理的RAW264.7细胞吞噬功能与未处理组比较显著增强,经LPS处理的重组载体转染组与空载体转染组比较吞噬功能增强;RT-PCR结果表明:hCAP-18/LL-37基因转染可促进RAW264.7细胞CD80和CD86的mRNA表达,促进TLR4及细胞因子IL-1β,TNF-α的mRNA表达;MTT法检测hCAP-18/LL-37基因转染RAW264.7细胞培养上清可显著促进脾细胞的增殖,hCAP-18/LL-37基因转染LPS处理的RAW264.7细胞的培养上清可显著促进脾细胞与RAW264.7细胞本身的增殖活性。研究结果提示:hCAP-18/LL-37基因转染可促进LPS处理的RAW264.7细胞的增殖活性与吞噬功能;hCAP-18/LL-37基因转染可上调RAW264.7细胞CD80和CD86、TLR4及细胞因子IL-1β,TNF-α的mRNA表达。hCAP-18/LL-37基因转染RAW264.7细胞培养上清可促进小鼠脾细胞与RAW264.7细胞本身的增殖活性。表明hCAP-18/LL-37具有促进巨噬细胞抗原提呈与吞噬及调节炎症反应的功能。为抗菌肽的临床应用提供了新的理论与实验依据。

论文目录

提要

第1章文献回顾

1.1 抗菌肽的分类及结构特点

1.2 抗菌肽的主要生物学活性

1.2.1 抗菌肽的抗微生物作用

1.2.2 抗菌肽的抗肿瘤作用

1.2.3 抗菌肽在伤口的修复和血管形成方面的作用

1.2.4 抗菌肽的免疫调节作用

1.3 抗菌肽与 TLRs

1.4 抗菌肽与巨噬细胞

第2章实验研究

2.1 实验材料

2.1.1 细胞株、菌株及质粒

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器设备

2.1.4 主要试剂的配制

2.2 试验方法

2.2.1 hCAP-18/LL-37 重组质粒的鉴定与扩增

2.2.2 hCAP-18/LL-37 真核表达载体瞬时转染RAW264.7 细胞

2.2.3 MTT 法检测基因转染RAW264.7 细胞的增殖活性

2.2.4 流式细胞仪检测细胞周期与凋亡

2.2.5 中性红吞噬实验检测RAW264.7 细胞的吞噬功能

2.2.6 RT-PCR 法检测RAW264.7 细胞CD80、CD86，TLR4及细胞因子TNF-α、IL-1β的mRNA 表达

2.2.7 细胞培养上清活性的检测

2.3 实验结果

2.3.1 hCAP-18/LL-37 重组质粒酶切鉴定

2.3.2 hCAP-18/LL-37 基因瞬时转染RAW264.7 细胞mRNA 表达

2.3.3 hCAP-18/LL-37 基因转染对RAW264.7 细胞增殖活性的影响

2.3.4 hCAP-18

2.3.5 hCAP-18/LL-37 基因转染对RAW264.7 细胞吞噬功能的影响

2.3.6 hCAP-18/LL-37 基因转染对 RAW264.7 细胞 CD80、CD86,TLR4 及细胞因子 TNF-α、IL-1β 的 mRNA 表达的影响

2.3.7 细胞培养上清活性的检测结果

第3章讨论

结论

参考文献

致谢

中文摘要

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