论文摘要
目的：研究新型乳腺癌生长抑制因子BDGI治疗4T1高转移乳腺癌的抗肿瘤作用，通过比较各组细胞因子及病理学变化，观察BDGI基因对4T1乳腺癌的治疗效果并探讨其可能机制，为BDGI基因治疗乳腺癌提供实验依据。方法：一、动物实验将处于对数生长期的4T1细胞皮下注射于54只小鼠体内建立乳腺癌实验动物模型，24h后随机分组为治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ、空质粒治疗组、对照组、CTX组、联合组建模后第3天，以不同剂量的药物皮下注射各组小鼠，共3次（间隔3天）。观察荷瘤小鼠健康、生存状况、肿瘤生长情况。在未次治疗后第7天脱颈椎处死部分小鼠（3只／组），取脾脏制备淋巴细胞悬液，用MTT法测NK杀伤活性；T淋巴细胞悬液铺板、收集培养上清，-20℃保存，待检测细胞因子；取肿瘤组织称重，10％甲醛固定，待进行病理观察；取肺组织，10％甲醛固定，待进行病理观察肿瘤组织转移情况；剩余小鼠留做生存期观察；二、NK杀伤活性测定将已处死的小鼠在无菌条件下摘取脾脏，放入研钵中轻轻研磨，经120目网过滤去除脂肪组织，制取细胞悬液，计数后，调整其浓度为2×106ml，直接用做效应细胞，靶细胞为YAC-1，浓度为2×105／ml。采用MTT法测定NK细胞杀伤活性。三、病理观察肿瘤组织、肺组织依次经过10％甲醛固定、EDTA脱钙、乙醇梯度脱水、常规包埋及切片，苏木素-伊红（HE）染色，镜检观察组织病理变化，比较各组间差异。四、细胞因子检测收集T淋巴细胞悬液培养上清，细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ的测定均按照EIA试剂盒说明书要求进行，即将待测培养上清和不同浓度的标准品加入相应孔中（100ul／孔），37℃孵育120分钟，洗板5次，在每孔加入第一抗体工作液50ul，37℃孵育60分钟，洗板5次，每孔加入酶标抗体工作液100ul，37℃孵育60分钟，沈板5次，每孔加入底物工作液100ul，37℃暗处反应5分钟，每孔加入50ul终止液混匀，上机490nm波长检测吸光值，绘制标准曲线计算检测结果。结果：一、病理切片显示肿瘤组织：各组肿瘤细胞大小不等、形态多样，有较多核碎片分布，癌细胞异型性明显。与对照组、空质粒治疗组相比，治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ、CTX组、联合组有一定程度的炎性细胞和淋巴细胞浸润，伴有部分肿瘤组织的坏死，但组间差异并不显著。肺组织：对照组、空质粒治疗组、治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ可见明显的肺转移灶，肿瘤细胞大小不一、形似瓜子或燕麦，部分呈条索状排列，间有血窦、伴有一定程度的炎性细胞和淋巴细胞浸润。CTX组、联合组未见转移灶出现，肿瘤转移受到明显抑制。二、NK杀伤活性测定与对照组相比各治疗组小鼠NK细胞杀伤活性显著增高（P＜0.05）；与空质粒治疗组相比，各治疗组小鼠NK细胞的杀伤活性显著增高（P＜0.05）；与CTX组相比，CTX组NK细胞杀伤活性高于组治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ（P＜0.05），但与联合组无显著差异（P＞0.05）；组间比较，治疗组ⅡNK细胞杀伤活性高于治疗治疗组Ⅰ（P＜0.05），联合组高于治疗组Ⅱ（P＜0.05）。三、细胞因子检测1、重组pcDNA3.1-BDGI对荷瘤小鼠IFN-γ的影响：与对照组相比空质粒治疗组无显著差异，其它各治疗组小鼠IFN-γ显著增高（P＜0.05）；与空质粒治疗组相比各治疗组小鼠IFN-γ显著增高（P＜0.05）；与CTX组相比，CTX组IFN-γ显著高于组治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ（P＜0.05），但与联合组无显著差异（P＞0.05）；组间比较，治疗组ⅡIFN-γ显著高于治疗治疗组Ⅰ（P＜0.05），联合组显著高于治疗组Ⅱ（P＜0.05）。2、重组pcDNA3.1-BDGI质粒治疗对荷瘤小鼠IL-2的影响与对照组相比，空质粒治疗组无显著差异，其它各治疗组小鼠IL-2显著增高（P＜0.05）；与空质粒治疗组相比各治疗组小鼠IL-2显著增高（P＜0.05）；与CTX组相比，CTX组IL-2显著高于组治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ（P＜0.05），但与联合组无显著差异（P＞0.05）；组间比较，治疗组ⅡIL-2显著高于治疗治疗组Ⅰ（P＜0.05），联合组显著高于治疗组Ⅱ（P＜0.05）。3、重组pcDNA3.1-BDGI质粒治疗对荷瘤小鼠TNF-α的影响与对照组相比，空质粒治疗组无显著差异，各治疗组小鼠TNF-α显著增高（P＜0.05）；与空质粒治疗组相比各治疗组小鼠TNF-α显著增高（P＜0.05）；与CTX组相比，CTX组TNF-α显著高于组治疗组Ⅰ、治疗组Ⅱ（P＜0.05），但与联合组无显著差异（P＞0.05）；组间比较，治疗组ⅡTNF-α显著高于治疗治疗组Ⅰ（P＜0.05），联合组显著高于治疗组Ⅱ（P＜0.05）。结论：1．在小鼠4T1乳腺癌模型中，联合BDGI和CTX或提高BDGI剂量，可抑制肿瘤的生长。治疗组Ⅱ和联合治疗组的小鼠生存期延长。2．联合BDGI和CTX或提高BDGI剂量治疗增强了脾细胞NK杀伤活性，并诱导了更多的Th1细胞因子（IL-2、IFN-γ）及TNF-α的分泌，诱导机体产生特异性和非特异性的抗肿瘤免疫效应。3．联合BDGI和CTX进行治疗可有效抑制了肿瘤的肺转移。4．联合治疗组和高剂量治疗组小鼠肿瘤周围有更多的炎性细胞浸润，肿瘤组织出现坏死，但组间差异并不显著。5．BDGI对乳腺癌的治疗存在一定的剂量依赖关系。上述结果提示BDGI在恶性肿瘤的基因治疗中具有潜在的应用价值，为开辟治疗恶性肿瘤的新方法和新途径提供了新思路。