论文摘要
近年来在食品中发现有较多的晚期糖基化末端产物（advanced glycation endproducts，AGEs），尤其是脂类加工的食品中AGEs的含量较高。大量动物实验和临床实验表明，食源性AGEs对人体健康具有潜在危害性。为了研究脂类食品中AGEs的生成机理，本论文选取羧甲基赖氨酸（Nε-carboxymethyllysine，CML）作为AGEs的代表，将CML的产生和食品加工过程相关联。按照从微观机理到宏观表象的整体研究思路，以模拟体系作为出发点，逐步将研究体系扩展到真实食品体系。从反应历程、中间产物、自由基和碳源四个角度深入探讨了脂类食品体系中CML的生成机理，为有效控制食品加工过程中潜在化学危害物的产生提供理论依据。主要研究内容及成果如下。（一）非脂类模拟体系中CML的化学反应动力学研究了非脂类模拟体系赖氨酸（lysine，Lys）+葡萄糖（glucose，Glu）中CML的生成规律，为随后研究脂类对CML生成路径的作用机理提供基础。首先，建立Lys+Glu模拟体系，采用高效液相色谱-质谱仪（high performance liquid chromatography-fluorescence，HPLC-MS）结合外标法研究了其在100℃、80℃、60℃和40℃加热不同时间过程中，模拟体系中目标产物CML、中间产物果糖基赖氨酸（fructoselysine，FL）与乙二醛（glyoxal，GO）和原料Lys与Glu含量的生成规律。其次，通过添加邻苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）阻断GO生成CML的方法研究了FL路径和GO路径对生成CML的贡献率大小。最后，根据可逆-连串-并行的复合反应机理，理论推导出100℃条件下CML、FL、GO、Lys和Glu的化学反应动力学公式，结合Origin软件的非线性拟合功能对实验数据进行拟合，得到CML各级反应的表观速率常数和表观动力学方程。结果表明，CML在100℃条件下具有热稳定性，能够在食品中积累。FL和GO作为生成食源性CML的重要中间产物，在食品加工过程都存在一个极大值点。100℃条件下FL路径生成CML占主导地位，贡献率为84.7%，而GO路径生成CML占次要地位，贡献率为15.3%。分别建立了100℃条件下FL路径和GO路径生成CML的表观动力学方程。因此，有望通过在食品加工过程中调控加工参数和添加抑制剂等方式来控制食源性CML的产生。（二）脂类模拟体系中CML的生成机理从自由基和碳源两个角度探讨了脂类模拟体系中CML的生成机理。在自由基方面，首先利用Fenton试剂考察了羟基自由基（hydroxyl radical, OH·）对Lys+Glu+Fenton模拟体系和Lys+GO+Fenton模拟体系生成CML路径的作用。在此基础之上，研究了亚油酸（linoleic acid，Lin）、油酸（oleic acid，Ole）、三油酸甘油酯（trioleate，Tri）和甘油（glycerol，Gly）对Lys+Glu+Lipid模拟体系中OH·、CML、FL、GO和Glu含量的影响，以及对Lys+GO+Lipid模拟体系中CML和乙醛酸（glyoxalic acid，GOA）的影响。结果表明，OH·对美拉德反应体系中生成CML的三条路径都具有促进作用。Lin、Ole和Tri能够促使美拉德反应体系产生更多的OH·，这些OH·促进了模拟体系中的FL和GO向CML的转化。Gly对OH·具有清除作用，从而降低了模拟体系中的CML含量。就引发自由基而言，对CML的促进作用按照从大到小排列为：Ole﹥Lin﹥Tri﹥Glu﹥Gly。在碳源方面，对模拟体系中的Glu和Gly分别进行13C同位素标记，通过追踪被标记碳原子通过GO路径生成CML的过程，证实油脂生成CML的新反应路径。通过计算CML含量中，通过GO路径分别来自Lin、Ole、Tri和Gly的比例，比较脂氧化和糖氧化对生成CML的贡献率。结果表明，Lin、Ole、Tri和Gly在氧化过程中产生的GO参与了CML的生成。在100℃条件下，相对于Glu对生成GO的贡献率而言，Lin、Ole和Tri对生成GO的贡献率在4.0h处达到极大值，分别为3.53%、3.08%和1.81%，然而，Gly对生成GO的贡献率随着加热时间的延长而逐渐增多，在8.0h处达到最大值99.29%。相对于Glu通过GO路径和FL路径生成CML的贡献率而言，Lin、Ole、Tri通过GO路径对生成CML的贡献率随着加热时间的延长而逐渐增多，在8.0h处达到最大值，分别为7.45%、5.31%和4.10%，Gly通过GO路径对生成CML的贡献率在6.0h处达到极大值10.33%。Lin、Ole、Tri和Gly都能够通过自身氧化断裂生成GO，提供生成CML的碳源。就中间产物而言，对CML的贡献按照从大到小排列为：FL路径（针对Glu）﹥Gly氧化产生GO路径﹥GO路径（针对Glu）﹥Lin氧化产生GO路径﹥Ole氧化产生GO路径﹥Tri氧化产生GO路径。因此，脂类对CML生成的促进作用来源于两个方面：（1）促使美拉德反应模拟体系产生更多OH·，促进CML的产生；（2）不饱和脂肪酸和Gly氧化产生GO，成为生成CML的碳源。（三）植物油模拟体系中CML的生成规律基于前述的模拟体系中CML生成机理，进一步将研究体系从脂类模拟体系扩展到半真实脂类食品体系——植物油模拟体系，即研究大豆油（soybean oil，Soybean）、玉米油（corn oil，Corn）、橄榄油（olive oil，Olive）、棕榈油（palm oil，Palm）和菜籽油（rape oil，Rape）等五种常用植物油对Lys+Glu+Oil模拟体系中OH·、目标产物CML、中间产物FL与GO含量的影响。结果表明，油脂能够促使美拉德反应模拟体系产生更多的OH·，这些OH·促进了模拟体系中的FL和GO向CML的转化。五种植物油对模拟体系中CML的促进作用按照从高到低排序为Soybean﹥Corn﹥Olive﹥Palm﹥Rape。对五种油脂中主要脂肪酸比例的分析表明，油脂对模拟体系中CML的促进作用和油脂中不饱和脂肪酸含量存在正相关性，即含有较多不饱和脂肪酸的油脂能够在美拉德反应模拟体系中引发较多的OH·，从而促进GO和FL向CML转化。因此，在食品加工过程中，含有较多不饱和脂肪酸的油脂更容易促进CML的产生。（四）真实食品体系中CML的生成规律将研究体系从半真实脂类食品体系进一步扩展到真实食品体系。选用一种氨基酸饮料作为非脂类真实食品体系的代表，选用牛奶作为脂类真实食品体系的代表。考察了氨基酸饮料在60℃保温箱里储存48h过程中的CML生成规律。在脱脂奶（skim milk，SM）和低乳糖奶（low lactose milk，LLM）中添加天然奶油，比较了3%、6%和9%奶油添加量对牛奶中CML生成的影响。结果表明，随着加热时间的延长，氨基酸饮料中CML含量逐渐增加。而牛奶在100℃条件下加热30min，其CML的含量随着加热时间的延长而逐渐增加，LLM比SM能够产生更多的CML。因此，在食品储藏过程中，食源性CML会随着储藏时间的延长而逐渐积累。在食品加工过程中，脂类食品体系中CML的含量随着油脂含量的增加而逐渐增加。
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标签：晚期糖基化末端产物论文; 羧甲基赖氨酸论文; 食品论文; 油脂论文; 自由基论文;