食管鳞癌中PI3K/AKT、MAPK和Shh信号通路间交叉调控的实验研究

论文摘要

食管癌是常见的原发性消化道恶性肿瘤,其在世界范围内的发病率和死亡率分别位于恶性肿瘤的第8位和第6位。我国是食管癌高发区,而且90%以上是食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）。由于大部分食管癌直到疾病的晚期症状都不明显,ESCC病人往往诊断晚、预后差、死亡率高。ESCC是一种严重危害人民群众身体健康的疾病。在ESCC的发生、发展中有多个信号通路参与其中,这些信号通路之间的相互交叉调控最终使肿瘤细胞获得无限增殖的生长优势,从而促进肿瘤的发生和发展。近年来研究表明,Sonic Hedgehog（Shh）信号转导通路与食管、胃、胰腺等消化道肿瘤的发生密切相关。Shh通路在食管癌中呈高度激活状态,可当作一项有价值的生物标记用于食管癌的诊断和分子分类。此外,多个研究表明Ras信号通路在恶性肿瘤的发病过程中起着重要作用,磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositol-3-OH-kinase, PI3K） / AKT信号通路和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路是Ras下游的两个主要通路,上述两个信号通路主导的促有丝分裂和抗凋亡信号在人恶性肿瘤细胞的生长和预后中扮演重要角色。目前国内外仅有小宗ESCC关于Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路独自的研究,尚无Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路交叉调控与ESCC病理类型、增殖活性、生物学行为等方面的研究报道。为探讨Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路在ESCC发生和发展过程中的作用,本课题通过检测人ESCC中Shh、Gli1、p-AKT和p-ERK的表达,以及这些基因的表达与ESCC临床病理特征、食管癌患者的预后等相互关系进行了研究,并利用ESCC细胞系TE-1和TE-10进行体外实验研究,采用特异性拮抗剂对Shh通路、PI3K/AKT通路和MAPK通路进行靶向抑制,然后检测各个通路关键因子的表达情况。通过上述实验设计,验证ESCC中可能存在的Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路之间串话的机制。探讨了联合抑制Shh和PI3K/AKT信号通路作为基因治疗ESCC优选靶的之一的可行性,初步探讨Shh和PI3K/AKT信号通路影响ESCC生物学特性的可能机制。第一部分人食管鳞状细胞癌组织中Shh、Gli1、p-AKT和p-ERK表达的实验研究目的:明确Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路中的关键因子Shh、Gli1、p-AKT和p-ERK在人ESCC组织中的表达情况,探讨Shh、PI3K/AKT通路和MAPK通路之间的相关性。方法:收集30例经开胸手术切除的ESCC新鲜组织标本,分为ESCC组织组和癌旁正常食管组织组。用western-blot方法检测两组标本中Gli1、p-AKT和p-ERK蛋白的表达情况;此外,收集88例2004年1月至2005年12月手术切除标本存档蜡块,分为ESCC组织组和癌旁正常食管组织组,采用免疫组化染色的方法检测两组标本中Shh、Gli1、p-AKT和p-ERK蛋白的表达情况。结果:1、Western-blot方法检测表明:在癌旁正常食管粘膜中未检测到Gli1和p-AKT的表达,而在大部分ESCC中检测到Gli1和p-AKT呈阳性表达;在正常食管粘膜中p-ERK不表达或呈弱阳性表达,而在大部分ESCC中检测到p-ERK呈阳性表达。2、免疫组化检测表明:在正常食管粘膜中未检测到Shh、Gli1和p-AKT的表达,而在大部分ESCC中检测到Shh、Gli1和p-AKT呈阳性表达;在正常食管粘膜中p-ERK不表达或呈弱阳性表达,而在大部分ESCC中检测到p-ERK呈阳性表达。统计分析表明ESCC中Hh靶基因Gli1的高表达与AKT激活相关,但跟ERK激活不相关。结论:在大部分食管癌组织中Shh、Gli1、p-AKT和p-ERK是高表达的,但在癌旁正常食管组织中是不表达的,提示Shh、PI3K/AKT和MAPK通路在大多数食管癌中是激活的。Gli1的表达与p-AKT的表达呈正相关,提示Shh和PI3K/AKT信号通路之间可能存在交叉调控,即信号通路之间的“串话”。第二部分Shh信号通路与PI3K/AKT、MAPK信号通路之间交叉调控机制的体外试验目的:明确Shh通路、PI3K/AKT通路和MAPK通路之间是否存在“串话”,以及它们之间“串话”的机制。方法:采用ESCC细胞株TE-1/TE-10,分别用EGF、Gβγ和N-Shh来诱导激活TE细胞株,并借助各个通路药理学抑制剂阻滞相关通路,通过检测各个通路的关键因子来研究Shh、PI3K/AKT和MAPK通路之间交叉调控的机制,此外还检查了阻断上述通路对于Gli1活性的影响,以及联合阻断上述通路对于TE-1/TE-10在细胞增殖、凋亡方面的影响。结果:1、EGF、Gβγ和N-shh均能诱导上调TE细胞株中p-AKT、p-ERK和Gli1的表达。2、EGF诱导TE细胞p-AKT或p-ERK表达效应可分别被wortmannin或PD98059抑制,但不能被cyclopamine抑制。3、TE细胞转染Gβγ激活AKT或ERK可被GRK-ct阻滞,但不能被cyclopamine阻滞。4、EGF诱导TE细胞Gli1表达效应可被wortmannin抑制,但不能被PD98059或GRK-ct阻滞。5、TE细胞转染Gβγ诱导Gli1表达效应既可被cyclopamine或wortmannin阻滞,但不能被PD98059阻滞。6、N-Shh诱导TE细胞株p-AKT或p-ERK表达上调可分别被wortmannin、PD98059或cyclopamine抑制。7、EGF诱导TE细胞增殖加速效应可被PD98059预处理所阻滞,仅有部分被cyclopamine预处理所阻滞;N-Shh诱导TE细胞增殖加速效应可被cyclopamine预处理所阻滞,而PD98059则可完全阻滞细胞活性;8、血清饥饿可以诱导TE细胞caspase 3表达显著增加,而显著降低p-AKT的表达,wortmannin或cyclopamine均不能阻滞该效应。9、EGF能影响TE细胞中Gli1的活性,该效应可被wortmannin或cyclopamine阻滞。结论:EGF或Gβγ介导的AKT或ERK激活与Shh通路无关,ESCC细胞株TE-1/TE-10中PI3K/AKT信号通路在EGF、Gβγ和Shh诱导的Hh信号中起重要作用。Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路在食管癌细胞增殖和抑制凋亡过程中协同作用。食管癌细胞经EGF刺激诱导后Gli1从细胞质向细胞核的易位也依赖于AKT的激活而非ERK的激活。第三部分食管鳞癌中Shh、Gli1、p-AKT和p-ERK免疫组化表达与临床病理因素间的相关性分析目的:明确ESCC中Shh、Gli1、p-AKT和p-ERK的表达与临床病理特征及预后之间的关系。方法:采用电话或信函随访的方式,了解食管癌患者术后生存的情况,使用统计学方法研究Shh、Gli1、p-AKT和p-ERK免疫组化表达在食管鳞癌中的分布特征,并和食管鳞癌临床特征诸如患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、淋巴结转移、肿瘤侵润深度、癌分化程度、肿瘤TNM分期及术后生存期对比分析。结果:Shh阳性表达在淋巴结转移阴性和淋巴结转移阳性的食管癌患者之间比较,有统计学上显著差异性（p = 0.027）,且Shh的阳性表达与预后差密切相关（p = 0.017）;Gli1阳性表达在淋巴结转移阴性和淋巴结转移阳性的食管癌患者之间比较,有统计学上显著差异性（p = 0.043）,且Gli1的阳性表达与预后差密切相关（p = 0.005）;此外,p-AKT的阳性和肿瘤侵润深度不同的食管癌患者之间比较,有统计学上显著差异性（p = 0.008）,并且p-AKT的阳性表达与预后差密切相关（p = 0.001）。结论:ESCC中Shh、Gli1阳性表达与淋巴结转移相关,而p-AKT阳性表达则与肿瘤侵润深度相关,Shh、Gli1和p-AKT的阳性表达均与较差的预后相联系。在ESCC治疗策略上联合抑制Shh和PI3K/AKT通路可能更加有效。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 人食管鳞状细胞癌组织中 Shh、Gli1、p-AKT 和p-ERK表达的实验研究
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 Shh 信号通路与PI3K/AKT、MAPK 信号通路之间交叉调控的体外实验
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 食管鳞癌中Shh、Glil、p-AKT 和p-ERK 免疫组化表达与临床病理因素间的相关性分析
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 综述
• 参考文献
• 在读期间完成和发表论文
• 致谢