人工发酵虫草菌丝体干粉对1型糖尿病大鼠肾脏保护作用的实验研究

论文摘要

目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病（diabetes mellitus,DM）最主要的微血管并发症之一,也是终末期肾功能衰竭（ESRF）的主要病因。目前在我国,DN发病率呈逐年上升趋势。探索DN发病机制,制定更加有效的防治措施,已成为当前糖尿病学界和肾脏病学界十分热点的课题。中医药防治DM历史悠久,经验丰富,有独特的学术体系。中药具有多途径、多环节、多靶点的作用特点,很多研究表明中药在降糖的同时,能增强患者体质,纠正糖、蛋白质和脂肪代谢紊乱[1][2][3]。冬虫夏草[Cordyceps sinensis （Berk.） Sacc.]为麦角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体,传统医学认为其入肺、肾经,有补肺肾、益虚损、扶精气之功效。现代医学认为,DN的主要病理改变是肾基底膜增厚和以肾小球系膜区为主的细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）沉积。Ⅳ型胶原（collagen typeⅣ,Col-Ⅳ）是ECM增殖的主要成分,是导致DN的主要病理基础。转化生长因子-β（1transforming growth factor-β1,TGF-β1）储存于细胞表面或细胞外基质（ECM）中,介导血糖升高对肾脏的多种化学反应,被认为是DN系膜细胞增生和ECM生成过多的重要媒介之一。DM时,糖、脂代谢紊乱使氧化自由基产生增多,升高的自由基能够直接损伤肾脏组织;同时高糖还可以影响清除自由基的各种抗氧化酶(总超氧化物歧化酶（TSOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-PX）等的活性,使损伤加重。本本研究通过链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）诱发Sprague-Dawlay（SD）大鼠胰岛功能缺陷和高血糖,复制1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus,T1DM）大鼠模型,并应用人工发酵虫草菌丝体干粉（冬虫夏草代用品）进行干预治疗。运用生物化学、病理形态学等方法检测肾脏组织中Col-Ⅳ、TGF-β1的表达情况和TSOD、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、CAT、GSH-PX的活性水平,探讨ECM增生、氧化应激与DN病变的关系以及人工发酵虫草菌丝体干粉的肾脏保护作用机理。方法:从60只8周龄SD大鼠中随机抽取12只作为正常对照组（A组）,其余作为实验组。将实验组大鼠给予STZ 55mg/kg腹腔注射,72小时后测尾尖血糖大于16.8mmol/L,持续3天,确认为1型糖尿病动物模型。把糖尿病大鼠随机分为糖尿病对照组（B组）、人工发酵虫草菌丝体干粉干预治疗组:1.2g/kg/d干预组（C组）、2.4g/kg/d干预组（D组）、3.6g/kg/d干预组（E组）。于第16周末测量大鼠体重,测定血糖（BG）、血中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）以及极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、24小时尿肌酐清除率（Ccr）和24小时尿白蛋白排泄量（urinary albumin excretion,UAE）水平。以肾组织制备光镜及电镜切片,进行形态学观察;通过苦味酸-甲苯胺蓝染色法检测ECM含量;应用免疫组化方法检测Col-Ⅳ、TGF-β1在肾脏组织中的蛋白表达水平,并用真彩色病理图像分析系统进行图像分析,计算Col-Ⅳ、TGF-β1的积分光密度值（IOD）的积分均值。应用黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法等生物化学方法检测TSOD、MDA、CAT、GSH-PX的活性。使用SPSS12.0统计软件处理实验数据,两组比较采用t/t’检验,组间比较采用方差分析。结果1实验第4周末检测指标:实验组大鼠体重小于正常对照组（P<0.05）,BG水平均高于正常对照组（均P<0.01）。2实验第16周末生化指标:B组大鼠BG、TG、TC、LDL-C及VLDL-C水平均高于A组,HDL-C水平低于A组（均P<0.05）;C组、D组、E组大鼠TG、TC、LDL-C、VLDL-C水平均低于B组,HDL-C均水平高于B组（均P<0.05）,C组、D组、E组之间上述指标无显著性差异（均P>0.05）。C组、D组血糖水平较B组、E组显著下降（均P<0.05）,B组、E组之间无显著性差异（均P>0.05）。B组大鼠血BUN、Scr、尿UAE明显高于A组大鼠（均P<0.01）。C组、D组、E组血BUN、Scr、尿UAE均较B组显著下降,其中E组较B组下降最明显,均有显著性差异（分别P<0.05, P<0.05, P<0.01）。B组Ccr水平明显低于A组（P<0.05）,C组、D组、E组Ccr较B组显著升高（P<0.05）,其中E组Ccr较B组升高更明显（p<0.01）。3组织形态学结果:HE及苦味酸-甲苯胺蓝染色示B组大鼠肾小球面积增大,襻腔扩张,系膜基质显著增生,部分小球表现为结节样硬化,肾小球基底膜及囊壁增厚。（肾小管没有描述）电镜观察示B组肾小球基底膜不规则增厚,系膜区扩张,系膜基质增多;C组、D组、E组均较B组明显减轻,E组减轻最明显。4肾脏组织TGF-β1、Col-Ⅳ蛋白表达:TGF-β1染色阳性面积占肾小管-间质面积百分比（%）的结果证实在B组TGF-β1染色阳性比例（21.24±2.45）相对于A组（5.85±0.65）明显增多（p<0.01）;C组（13.90±1.71）、D组（9.72±2.02）、E组（7.82±2.09）相对于B组,TGF-β1染色阳性比例有不同程度的减轻,减轻程度随剂量增加而增加三组之间有显著性差异（均为p<0.05）。光镜下,Col-Ⅳ在A组肾小球系膜、基底膜及肾小管-间质有少量表达,B组的表达明显增强,C组、D组、E组增生情况较B组明显减弱。图像分析示:B组Col-Ⅳ的IOD（13.02±1.74）明显高于A组（6.27±0.72）（p<0.01）,C、D、E组IOD（分别为10.24±1.32,9.02±1.20,7.92±1.18）较B组显著降低（均为p<0.01）,其中E组IOD较C、D组降低更明显,有显著性差异（p<0.05）。相关分析表明TGF-β1的表达水平与Col-Ⅳ水平呈显著负相关（r=-0.509,p<0.01）。5肾脏组织各种抗氧化酶的活性:抗氧化酶TSOD、CAT活性在B组（分别为55.25±2.46u/mgpro、26.31±2.09u/mgpro）较A组（分别为79.55±4.67u/mgpro、47.95±3.05u/mgpro）明显下降, C组（分别为60.34±2.02u/mgpro、31.03±2.04u/mgpro）、D组（分别为67.26±2.01u/mgpro、33.47±1.09u/mgpro）、E组（分别为66.22±1.09u/mgpro、37.25±1.34u/mgpro）较B组均明显下降（均为p<0.05）;GSH-PX活性在B组（79.17±2.12活力单位）、C组（88.68±3.17活力单位）、D组（84.12±4.13活力单位）、E组（98.10±2.02活力单位）较A组（62.95±2.94活力单位）均明显升高,有显著性差异（均为p<0.05）。6肾脏组织中MDA水平: B组MDA水平（ 18.19±1.02nmol/mgpro ）显著高于A组（7.41±0.83nmol/mgpro）,C组（9.38±0.46nmol/mgpro）、D组（8.39±0.89nmol/mgpro）、E组（8.00±0.69nmol/mgpro）,各组间均有显著性差异（p<0.01或p<0.05）。结论1 STZ DM大鼠肾脏局部TGF-β1、Col-Ⅳ的蛋白表达明显高于正常大鼠,提示肾组织中TGF-β1、Col-Ⅳ的表达改变与DN发生密切相关。2 STZ DM大鼠肾脏组织中,反应性氧产物较正常大鼠明显增多,而抗氧化酶活性明显下降,提示糖尿病肾病的发生和发展可能与氧化应激水平密切相关。3人工培养虫草菌丝体干粉通过减少尿白蛋白排泄、调节血脂、降低血糖、改善组织氧化应激水平、调节TGF-β1的蛋白表达,减轻Col-Ⅳ的增生,发挥其防治DN的作用,具有明显的肾脏保护作用。4人工培养虫草菌丝体干粉还可能通过改善全身代谢,增强免疫力等途径来发挥其在DN中的保护作用。5本研究中观察到,在一定剂量范围内,人工发酵虫草菌丝体干粉有降糖作用;较大剂量人工发酵虫草菌丝体干粉降糖效果不明显,有待进一步实验观察。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 人工发酵虫草菌丝体干粉对1 型糖尿病大鼠肾脏保护作用的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附表
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 冬虫夏草在糖尿病肾病中的保护作用研究
• 致谢
• 个人简历