骨髓间充质干细胞向心肌细胞和内皮细胞分化的研究

论文摘要

背景:由于人们生活水平的提高,冠心病成为现代社会发病率和死亡率不断上升的疾病,而急性心肌梗死是重要的死亡原因。心肌梗死后,心肌细胞坏死、凋亡造成心肌细胞数目减少,由于心肌细胞不能再生,只能由成纤维细胞填充,因此在心肌缺血发生后坏死的心肌由瘢痕组织取代,并逐步发生心室重构导致心脏收缩功能下降和心力衰竭。目前心肌梗死后的治疗手段主要包括药物治疗、介入治疗和手术治疗。药物治疗通过减少心肌氧耗,在一定程度上缓解了病人的症状。冠脉介入治疗及心脏搭桥手术治疗只能恢复局部血液供应,挽救梗死区内存活的心肌细胞,延缓左室重构,改善病人预后,但无法使已梗死的心肌细胞再生,没能从根本上修复梗死区,因此仍有部分病人不可避免地发展为心功能不全甚至导致心源性死亡。近年来发展的细胞移植技术为心肌梗死的治疗提供了新的方向并受到了人们的广泛关注。通过细胞心肌移植术增加有功能的心肌细胞数目,可能是心肌梗死后心衰治疗的最有效方法之一。此外近年来提出的治疗性血管新生也已发展成为治疗缺血性疾病的新方法。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是骨髓中不同于造血干细胞的一类细胞,它在体内能够自我更新,保持未分化状态,在体外合适的培养条件下,易于扩增,具有向多种细胞类型分化的潜能。1999年,Makino等首次在体外成功地诱导MSCs定向分化为心肌细胞。同时MSCs具有分化为内皮细胞的理论基础和实验基础。2004年,Oswald等人发现在体外MSCs与VEGF165和2%胎牛血清共培养可诱导分化为内皮样细胞。这些实验为MSCs诱导分化为心肌细胞和内皮细胞进行细胞移植治疗缺血性心脏病提供了良好的实验基础。Notch信号通路在脊椎动物和无脊椎动物中高度保守,它在决定细胞分化上起重要作用。它对正常心血管系统的发育有重要作用,Notch信号表达不足或过量都会造成动物因心血管异常而死亡。此外,Notch信号系统在血管再生方面也有重要作用。Notch信号通路在MSCs向内皮细胞分化的过程中可能也起着重要的调节作用。本实验主要研究了大鼠MSCs体外向心肌细胞及内皮细胞诱导分化的可行性,并研究了Notch信号通路对大鼠MSCs向内皮细胞诱导分化产生的影响,以期为缺血性心脏病的细胞移植治疗提供良好的种子细胞。研究目的1.体外分离培养大鼠骨髓MSCs,研究大鼠骨髓MSCs的生物学特性。用5-氮胞苷（5-Azacytidine,5-aza）定向诱导MSCs向心肌细胞分化,研究MSCs体外向心肌细胞分化的可行性。2.定向诱导大鼠骨髓MSCs向内皮细胞分化,研究MSCs体外向内皮细胞分化的可行性。研究诱导前后细胞增殖能力、迁移能力和形成毛细血管样结构能力的变化。3.采用RT-PCR方法检测大鼠骨髓MSCs上Notch信号受体和配体mRNA的表达情况,研究MSCs向内皮细胞诱导分化前后细胞上Notch信号受体和配体mRNA的表达变化。向诱导后内皮细胞中导入VEGF165基因来促进细胞的增殖和迁移能力。检测转染VEGF165基因前后细胞上Notch信号受体和配体mRNA的表达变化,检测细胞增殖能力、迁移能力和形成毛细血管样结构能力的变化,研究Notch信号对诱导后内皮细胞的增殖能力、迁移能力和形成毛细血管样结构能力的影响,以期更好的诱导MSCs向内皮细胞分化,促进诱导后内皮细胞的增殖、迁移和形成毛细血管样结构的能力,为缺血性心脏病的细胞移植治疗提供良好的种子细胞。方法1.采用密度梯度离心法和贴壁细胞分离培养法体外分离培养大鼠骨髓单个核细胞,显微镜下观察细胞的形态,采用流式细胞仪检测法鉴定细胞表面抗原的表达情况;采用5-aza诱导MSCs向心肌细胞分化,显微镜下观察诱导前后细胞形态的变化,采用免疫荧光法检测心肌细胞特异性蛋白Connexin 43和TroponinⅠ在诱导后细胞上的表达情况。2.采用密度梯度离心法和贴壁细胞分离培养法体外分离培养骨髓单个核细胞,采用VEGF165和bFGF诱导MSCs向内皮细胞分化,显微镜下观察诱导前后细胞形态的变化;采用免疫荧光法检测内皮细胞特异性蛋白Flk1和CD31在诱导后细胞上的表达情况;将细胞接种在半固体凝胶上观察细胞形成毛细血管样结构的能力;采用3H-TdR掺入法实验和细胞划痕实验检测诱导前后细胞增殖和迁移能力的变化。3.采用RT-PCR方法检测大鼠骨髓MSCs上Notch信号受体和配体mRNA的表达情况;后面的实验共分4组,A组:正常大鼠MSCs;B组:诱导后内皮细胞;C组:导入了VEGF165基因的诱导后内皮细胞;D组:阻断了Notch信号的C组细胞。采用RT-PCR方法检测四组细胞上Notch信号受体和配体mRNA的表达差异;采用3H-TdR掺入法实验和细胞划痕实验检测细胞增殖和迁移能力的变化;将细胞接种在半固体培养基上检测细胞形成毛细血管样结构的能力。结果1.大鼠骨髓MSCs的形态主要表现为长梭形和纺锤形,细胞表达整合素家族成员CD29、粘附分子CD44,但不表达造血前体细胞标志抗原CD34、泛白细胞标志抗原CD45;经5-aza诱导后,细胞形态变化不大,细胞表达心肌细胞特异性蛋白Connexin 43和TroponinⅠ。2.大鼠MSCs经VEGF165和bFGF诱导后,细胞形态由原来的长梭形、纺锤形变成圆形、椭圆形,细胞具备了内皮细胞的形态特征;细胞表达内皮细胞特异性标志物Flk1和CD31;诱导后细胞能够在半固体培养基上形成毛细血管样结构,且其增殖能力较大鼠MSCs有所降低（P＜0.01）,迁移能力有所增强（P＜0.01）。3.大鼠MSCs上表达有Notch信号受体Notch1和配体Jagged1的mRNA;大鼠MSCs向内皮细胞诱导后,细胞上Notch1和配体Jagged1的mRNA的表达无明显变化,诱导后细胞的增殖能力下降（P＜0.01）,迁移能力增强（P＜0.01）;给诱导后的内皮细胞导入VEGF165基因后,细胞上Notch信号配体Jagged1的mRNA的表达增强（P＜0.01）,细胞的增殖能力、迁移能力和形成毛细血管样结构的能力增强（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05）;当阻断了诱导后内皮细胞的Notch信号后,细胞的增殖能力、迁移能力和形成毛细血管样结构的能力更进一步增强（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05）。结论1.大鼠MSCs体外向心肌细胞诱导分化是可行的,诱导后的细胞获得了部分心肌细胞的表型。2.大鼠MSCs体外向内皮细胞诱导分化是可行的,诱导后的细胞具备部分内皮细胞的表型,并获得成熟内皮细胞的功能。3.大鼠MSCs上表达有Notch信号受体Notch1和配体Jagged1的mRNA。当向诱导后内皮细胞中导入VEGF165基因后,细胞上Jagged1 mRNA的表达水平上调。大鼠MSCs向内皮细胞诱导后,细胞的增殖能力有所下降,迁移能力有所增强。VEGF可以促进诱导后内皮细胞的增殖能力、迁移能力和形成毛细血管样结构的能力,而Notch信号对细胞的增殖能力、迁移能力以及形成毛细血管样结构的能力有抑制作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 中英文对照缩略词表
• 第一章 骨髓间充质干细胞的生物学特性及其向心肌细胞分化的研究
• 1.1 前言
• 1.2 材料与方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 结论
• 第二章 骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 第三章 Notch信号对骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的影响
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 参考文献
• 第一章的参考文献
• 第二章的参考文献
• 第三章的参考文献
• 综述
• Notch信号通路与心血管发育的关系
• 致谢
• 攻读博士学位期间所发表的论文