糙米发芽过程中内源蛋白酶特性及主要含氮物质变化研究

论文摘要

本研究选用江苏本地广泛种植的粳稻为原料,采用浸润发芽的方式,以酪蛋白或明胶为底物,通过溶液测定法和凝胶电泳技术,研究了糙米发芽过程中蛋白酶活力的变化,确定发芽糙米内源蛋白酶的基本特性,考察了发芽过程中生理指标变化,并分析了发芽过程中含氮物质变化和蛋白酶活力变化之间的相关性。研究结果如下：以酪蛋白为底物,研究了发芽糙米蛋白酶基本特性,结果表明：发芽糙米蛋白酶包含酸性和碱性两个活性基团,最适pH分别为3.5和8.0,最适温度为40℃,对酪蛋白的Km值分别为0.404 mg/mL和3.889 mg/mL。酸性蛋白酶活力可被Ba2+和Pb2+抑制,被Zn2+激活；碱性蛋白酶被Ca2+和Pb2+抑制,Mg2+和Zn2+则对其有促进作用。抑制剂检验显示：Pepstain A （Pep A）和碘乙酸（IAA）很大程度抑制了酸性蛋白酶活力,表明发芽糙米蛋白酶中存在天门冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶；金属蛋白酶则在碱性条件下可发挥较大的作用（金属离子螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）和1,10-菲啰啉（1,10-Phe）的抑制率达88.37%和74.82%）。还原剂L-半胱氨酸（L-Cys）、β-巯基乙醇（β-ME）和二硫苏糖醇（DTT）可显著提高发芽糙米酸性蛋白酶活力；碱性蛋白酶对底物酪蛋白的降解作用不受L-Cys和β-ME的影响,而DTT则对其有抑制作用。在酪蛋白为底物测定的基础上,以明胶为底物,采用凝胶电泳技术考察发芽糙米内源蛋白酶活性条带特征,结果表明：随着电泳的迁移,在pH 3.5和8.0时,发芽糙米蛋白酶分别有两条活性条带出现,且碱性蛋白酶条带检测到的时间早于酸性；抑制剂检测表明,酸性酶活条带为半胱氨酸蛋白酶,碱性酶活条带为金属蛋白酶；还原剂对两种蛋白酶活力条带表现出正效应或负效应；Mn2+可以解除EDTA对金属蛋白酶的抑制作用,且不受离子浓度影响；低浓度（0.5～1.0 mmol/L）Zn2+也可恢复由EDTA抑制的酶活力,但高浓度（5.0～7.5 mmol/L）时则起抑制作用。糙米发芽过程中,随发芽时间延长,芽长、发芽率、呼吸强度和干物质损失率逐渐增加,酸性蛋白酶活力呈先升高后降低的趋势,发芽前4 d内,碱性蛋白酶活力升高显著,之后变化趋于平缓；随着储藏蛋白的降解,肽含量逐渐增加,可溶性蛋白和游离氨基酸呈先升高后降低的趋势；至发芽结束,清蛋白和球蛋白含量显著降低,尤其在前5 d内降解迅速,SDS-PAGE电泳显示,两种蛋白组分中均有分子量较大亚基被完全降解；5 d后,谷蛋白含量开始下降,电泳显示57 KDa亚基降解显著；相关性分析表明：糙米发芽7 d,酸性蛋白酶同可溶性蛋白、肽含量、游离氨基酸呈显著正相关,碱性蛋白酶同可溶性蛋白和肽含量呈正相关,球蛋白与两种蛋白酶体系之间均呈显著负相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 糙米发芽过程中生理生化变化
• 1.1 呼吸作用
• 1.2 酶系统的形成和激活
• 1.3 储藏物质的代谢
• 2 蛋白酶
• 2.1 蛋白酶分类
• 2.2 影响蛋白酶活力的因素
• 2.2.1 底物
• 2.2.2 pH
• 2.2.3 温度
• 2.2.4 金属离子
• 2.2.5 抑制剂和还原剂
• 2.2.6 其他因素
• 2.3 蛋白酶活力测定方法
• 2.3.1 溶液测定方法
• 2.3.2 凝胶电泳技术
• 3 谷物种子内源蛋白酶研究进展
• 3.1 大麦
• 3.2 高粱
• 3.3 玉米
• 3.4 水稻
• 4 谷物种子发芽过程中蛋白质的降解
• 4.1 蛋白质降解过程
• 4.2 蛋白质降解的调控
• 5 本研究目的意义及主要研究内容
• 5.1 本研究目的意义
• 5.2 主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 发芽糙米内源蛋白酶特征研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验试剂
• 1.3 试验仪器
• 1.4 糙米主要成分分析
• 1.5 糙米发芽工艺
• 1.6 实验设计
• 1.6.1 酪氨酸吸收光谱验证
• 1.6.2 最适pH及pH稳定性测定
• 1.6.3 最适温度及热稳定性测定
• 1.6.4 动力学常数测定
• 1.6.5 金属离子的影响
• 1.6.6 有机物的影响
• 1.6.7 抑制剂的影响
• 1.7 蛋白酶活力测定方法
• 1.8 数据统计与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 酪氨酸紫外吸收光谱
• 2.2 发芽糙米内源蛋白酶基本特征
• 2.2.1 pH的影响
• 2.2.2 温度的影响
• 2.2.3 底物浓度的影响
• 2.3 金属离子对发芽糙米蛋白酶活力的影响
• 2.4 抑制剂对发芽糙米蛋白酶活力的影响
• 2.5 还原剂对发芽糙米蛋白酶活力的影响
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 糙米发芽过程中内源蛋白酶活性条带变化研究
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 发芽工艺
• 1.5 蛋白酶提取与电泳分析
• 1.6 实验设计
• 1.6.1 反应pH对发芽糙米蛋白酶活性条带的影响
• 1.6.2 反应温度对发芽糙米蛋白酶活性条带的影响
• 1.6.3 还原剂对发芽糙米蛋白酶活性条带的影响
• 1.6.4 抑制剂对发芽糙米蛋白酶活性条带的影响
• 1.6.5 金属离子对EDTA抑制酶活的恢复作用
• 2 结果与分析
• 2.1 PH对发芽糙米蛋白酶活性条带的影响
• 2.2 发芽糙米酸性蛋白酶活性条带变化
• 2.2.1 发芽时间的影响
• 2.2.2 反应温度的影响
• 2.2.3 抑制剂敏感性研究
• 2.2.4 还原剂敏感性研究
• 2.3 发芽糙米碱性蛋白酶活性条带变化
• 2.3.1 发芽时间的影响
• 2.3.2 反应温度的影响
• 2.3.3 还原剂敏感性研究
• 2.3.4 抑制剂敏感性研究
• 2.3.5 金属离子对EDTA抑制酶活的恢复作用
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 糙米发芽过程中主要含氮物质变化研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验试剂
• 1.3 试验仪器
• 1.4 发芽工艺
• 1.5 蛋白组分提取
• 1.6 测定指标与方法
• 1.6.1 生理指标
• 1.6.2 常规指标
• 1.6.3 蛋白酶活力
• 1.6.4 蛋白组分亚基
• 1.7 数据分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 糙米发芽过程中生理变化
• 2.2 糙米发芽过程中蛋白酶活力变化
• 2.3 可溶性蛋白、肽和游离氨基酸含量变化
• 2.4 蛋白组分含量变化
• 2.5 蛋白组分亚基变化
• 2.5.1 清蛋白亚基变化
• 2.5.2 球蛋白亚基变化
• 2.5.3 醇溶蛋白亚基变化
• 2.5.4 谷蛋白亚基变化
• 2.6 相关性分析
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文