人脂联素基因克隆、融合表达及纯化的研究

论文摘要

目的构建重组人脂联素（adiponectin,ADPN）原核表达载体,获取同源性、可溶性、高纯度的人重组脂联素融合蛋白,为进一步脂联素的深入研究及Ⅱ型糖尿病的早期诊断奠定基础。方法从人脂肪组织中提取RNA,经RT-PCR扩增,克隆出脂联素基因;用EcoRⅠ和HIndⅢ对人脂联素基因和载体pET32进行双酶切,构建pET32—ADPN重组质粒;将重组质粒转化BL21感受态细胞,通过氨苄青霉素抗性、PCR和重组质粒双酶切筛选重组子转化菌落,经DNA测序及BLAST比对确认脂联素基因序列正确性以及插入pET32质粒的位点和方向;用IPTG诱导表达、Western blotting鉴定,用镍离子金属螯合层析柱纯化重组融合蛋白。结果（1）通过RT-PCR,经1%的琼脂糖凝胶电泳观察,扩增的脂联素DNA片段与预期大小一致。（2）经双酶切及DNA测序鉴定脂联素DNA定向插入了pET32质粒。（3）用重组质粒转化大肠杆菌BL21、诱导表达和纯化目的蛋白。经Western—Blotting鉴定所诱导的蛋白为重组脂联素融合蛋白。结论成功构建了人重组脂联素蛋白原核表达载体、表达和纯化了脂联素融合蛋白,为进一步研究其生学物学功能和在Ⅱ型糖尿病中的作用机制奠定了基础。

论文目录

• 缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 综述
• 第一部分 重组脂联素原核表达载体的构建
• 1. 前言
• 2. 实验技术路线
• 3. 材料与器械
• 4. 实验方法
• 5. 实验结果
• 第二部分 脂联素融合蛋白的诱导、纯化及鉴定
• 1. 实验技术路线
• 2. 试剂与材料
• 3. 实验方法
• 4. 实验结果
• 讨论
• 总结
• 参考文献
• 攻读学位期间完成的科研成果目录
• 致谢