论文摘要
脂质体由于与活细胞的形式最为接近,在毒理、药理、生物学中得到广泛应用,是模拟细胞的良好实验模型,脂质体技术已成为生命科学中一个非常重要的工具和研究手段。脂质体作为实验模型,稳定性是最基本的条件,脂质体不是一般的热力学稳定体系,它的平均尺寸、层状结构以及物理的稳定性不仅仅取决于两亲分子的化学结构和尺寸,还取决于囊泡制备的方法以及周围的离子环境。本研究采用薄膜分散法和超声法,通过单因素和正交实验优化脂质体制备条件,得出最佳方案:选用2 mL 5 mmol/L大豆磷脂和胆固醇（摩尔比为1:1）氯仿溶液至圆底烧瓶中旋转蒸发10 min,旋转蒸发转速为5～6 r/min。用N2吹1-2min去除圆底烧瓶内残余的有机溶剂,加入pH7.8缓冲溶液,将磷脂的最终浓度调至1 mg/mL,振摇至膜全部溶脱;超声时间为5 min,超声频率为80%,室温下可以保存一个星期左右。为了更好的模拟细胞以及细胞所处的环境,我们将人工细胞定义为具有一定离子环境的脂质体体系。因此本实验选择生命体中最重要的简单无机离子Na+、K+、Ca2+,通过测量体系的浊度、Zeta电位和粒径以及显微镜计数等手段系统地研究了Na+、K+、Ca2+对脂质体的稳定性影响,得到单独加入某一种离子溶液时,脂质体能够稳定存在的离子浓度区间,在离子浓度区间内,脂质体不被破坏,而且数量基本保持不变。脂质体对加入Na+能够稳定存在的离子浓度（mmol/L）区间是[0.9,3],加入K+的稳定区间是[1,7],而Ca2+的稳定区间是[0.3,1]。其中,Ca2+在较低浓度下就能引起脂质体的失稳,而K+在很高的浓度下才会影响脂质体的稳定性,这都归因于K+的离子半径最小的原因。同时,我们采用Na、K、Ca离子选择性电极测量加入混合离子脂质体膜外的离子浓度,用pH计测量体系的pH,计算脂质体膜内离子浓度,试图寻找在混合离子存在竞争的情况下,离子穿透膜的机理。我们发现,脂质体中加入Na+、K+、Ca2+单一离子溶液,离子的渗透满足Donnan平衡;对于混合离子,本研究通过计算验证了脂质体中加入混合离子溶液符合Gibbs-Donnan平衡条件。无论是单独加入Na+、K+、Ca2+溶液还是加入混合的离子溶液,膜内的浓度要比膜外的高出很多,膜两边离子的渗透都是不平衡的,这种不平衡是Donnan效应引起的。自从Yoshikawa第一次报道人工液膜中存在化学振荡开始,人们就对化学振荡非常地感兴趣。本研究发现并证实了脂质体膜内外Na+、K+浓度的振荡是存在的,是一种在平衡附近的波动,是一个动态的过程,而不趋向于一种平衡。通过单因素实验和正交实验确定振荡的最佳条件:原材料选用蛋黄卵磷脂,胆固醇与蛋黄卵磷脂摩尔比1:1,膜外Na+和K+的浓度比例为2 mM:1 mM。振荡体系膜内外阴阳离子电荷守恒,阴离子与阳离子的振荡互补,是一种Gibbs-Donnan平衡基础上的振荡。振荡发生的充分条件是Gibbs-Donnan平衡;必要条件是一个离子浓度具有Marangoni效应,即处于非稳定区间,吸附提供了溶膜的动力,而另一个离子浓度处于稳定性区间,扩散提供了跨膜的动力,于是产生了一种非周期非规则的离子浓度振荡现象。由于温度对离子的渗透存在较大影响,用VP-DSC测量加入相同摩尔数离子脂质体体系的热量变化,本研究中采用脂质体膜外加入Na+和K+的浓度比例为2 mM:1 mM,则单一离子溶液选择3 mM,每个体系连续测量半个小时,结果发现随着温度的升高,振荡体系一直处于放热状态,无振荡体系由放热转变为吸热,在相同温度下,振荡体系热量的绝对值最大。本研究的实验结果不仅对不同场合的脂质体实验体系的应用具有重要的意义,而且对于理解生物细胞的离子环境也有一定的启发。