论文摘要
空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni,C.jejuni）是引起肠道感染的主要病原菌之一。除肠炎外,格林—巴利综合征（Guillain-Barre Syndrome,GBS）是空肠弯曲菌感染后的主要继发病症之一,导致GBS的空肠弯曲菌具有特异的遗传特征。2007年6月～7月,我国吉林省长春市发生36人的GBS暴发,流行病学调查结果表明,此次GBS的暴发与近期腹泻的流行密切相关,血清学检测结果显示,空肠弯曲菌是感染的主要病因。为进一步了解我国空肠弯曲菌菌株以及GBS相关菌株的遗传特征,本研究对长春GBS暴发相关菌株、我国河北省GBS患者分离菌株、北方地区腹泻病人、家禽及食物分离菌株进行分型分析,并对暴发GBS患者分离株ICDC07001进行全基因组序列分析。分析结果发现,长春GBS暴发相关菌株中,7株为空肠弯曲菌,7株为结肠弯曲菌,GBS患者及同期腹泻病人分离的菌株均为空肠弯曲菌。GBS患者分离菌株（ICDC07001）及同期腹泻病人分离菌株（ICDC07002,ICDC07003）的血清型均为HS:41,与GBS患者家养家禽分离菌株血清型不同。8株河北GBS患者分离菌株的血清型分别为S:19、HS:37、HS:2和不可分型。我国其它来源菌株的血清型分布分散,没有明显的优势血清型。PFGE分析结果发现,GBS暴发相关4株人源菌株带型一致,与3株家禽来源菌株不同。聚类分析显示,GBS暴发相关人源菌株与我国河北部分GBS相关菌株的带型相似。与美国PulseNet弯曲菌PFGE数据库中比较发现,本次GBS暴发相关菌株PFGE带型唯一,但与1995年发生在美国路易斯安娜州的一起水污染导致空肠弯曲菌感染暴发的菌株带型高度相似。其它不同来源菌株的PFGE带型分散,没有显著聚集特征。MLST分析发现,我国49株空肠弯曲菌分为33个ST型,分别属于13个ST序列群。eBURST聚类分析表明,我国菌株没有形成核心ST型。暴发相关人源菌株ST型相同,为本次研究新发现ST型,被命名为ST-2993。与ST-2993仅一个等位基因差异的ST-1672、ST-27和ST-1377共有4株菌,分别来源于GBS患者、菌血症患者及胃肠炎患者。40株GBS相关菌株的ST型SplitsTree聚类分析结果表明,GBS相关菌株没有形成显著的克隆群。菌株ICDC07001基因组含有一个染色体和一个拷贝的pTet质粒。质粒ICDC07001pTet（44.1kb）大小与暴发相关菌株81-176的pTet质粒81-176pTet（45.2kb）相近,含有37个CDSs。与其它测序菌株相比,ICDC07001（1.66Mb）基因组大小与其它人源空肠弯曲菌空肠亚种基因组相似,小于鸡来源菌株RM1221（1.78Mb）和空肠弯曲菌德莱亚种菌株269.97（1.85Mb）基因组。ICDC07001染色体上有一个反向插入一个大小约32kb的整合元素-弯曲菌Mu样噬菌体（Campylobacter Mu-like phage 1,CMLP1）整合元素的插入。与其它空肠弯曲菌相似,菌株ICDC07001染色体上铁吸收相关序列、细菌限制修饰系统相关序列和细菌表面结构相关序列等表现基因多样性。ICDC07001染色体上没有完整的插入因子或者转座子的插入。基因组序列比较发现,菌株ICDC07001与血清型相同的GBS患者分离菌株260.94有98.99%的基因同源。经比较获得菌株ICDC07001不同于其它测序菌株特异的25个CDSs,其中23个CDSs属于高变异区基因,分别位于插入整合元素CMLP1上、下游,CPS基因簇、LOS基因簇、FM基因簇、氧化磷酸化相关基因和Ⅰ型限制性修饰系统相关基因序列区域内。1个CDS与编码弯曲菌鞭毛分泌毒素FspA2基因同源,1个CDS与编码幽门螺杆菌插入因子IS606转移酶B基因部分同源。将ICDC07001分别与感染暴发相关菌株、GBS相关菌株以及胃肠炎相关菌株进行分组两两比较,组内共同基因分别进行组间比较分析,获得感染暴发相关共同基因27个、GBS相关共同基因13个（其中9个属于LOS基因簇基因）和胃肠炎相关共同基因18个。致病相关因子脂寡糖（LOS）、荚膜多糖（CPS）以及鞭毛基因合成修饰（FM）相关基因簇序列比较发现:菌株ICDC07001的CPS仅与血清型相同菌株260.94高度同源,而与其它GBS相关菌株的CPS同源性很低。LOS基因簇在GBS相关菌株中同源性明显高于其它菌株。菌株ICDC07001的FM基因簇与菌株260.94100%同源,而与其它菌株的同源比例明显降低。ICDC07001的LOS外核区基因簇属于类A类LOS,其唾液酸转移酶基因编码双功能唾液酸转移酶,可表达类神经节苷脂抗体GM1、GD1b的抗体,与GBS暴发患者血清中抗GM1、GD1b抗体显著增高一致。比较发现,黏附侵袭相关基因ciaB、cadF、peb1、jlpa、cdt以及双元调控因子相关基因属于种内保守基因。以16S rRNA,rpoB,fla以及flaA—SVR基因序列的相似性为基础进行菌株的遗传进化关系分析,结果发现:ICDC07001与260.94遗传距离最近,同时与菌株81-176、81116和HB93.13遗传距离相近。以菌株NCTC11168为模型,本研究建立了空肠弯曲菌蛋白质数据库,通过比较蛋白质组分析获得菌株在37℃/42℃优势表达蛋白并发现空肠弯曲菌毒力相关蛋白PEB1,CadF和CDT在不同温度下的表达没有显著差异。本研究建立了空肠弯曲菌感染病原的溯源分析手段,通过基因组的比较分析获得了菌株ICDC07001的特异遗传特征及相关致病因子遗传特点。进一步证明空肠弯曲菌的血清型与菌株的CPS基因相关,菌株感染后导致GBS与菌株的LOS基因相关。通过菌株分组比较,获得了空肠弯曲菌感染暴发、GBS相关以及胃肠炎相关共同基因,为空肠弯曲菌致病机制的研究奠定了基础。本研究建立了空肠弯曲菌蛋白质组数据库,37℃/42℃优势表达蛋白的获得为空肠弯曲菌在人类致病机理的研究提供依据。