DNA甲基化酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂治疗胰腺癌的实验研究

论文摘要

胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一,发病率和死亡率位居我国恶性肿瘤的前10位,且有逐年增高趋势。预后极差,近50年来,尽管传统的治疗手段如手术、放疗、化疗或这些方法的联合应用取得许多重大进展,但对胰腺癌患者的预后几乎没有显著改善,胰腺癌死亡率依然近乎等于发病。表观遗传学（Epigenetics）改变导致的基因表达改变是肿瘤发生的重要机制,包括DNA甲基化（DNA methylation）以及组蛋白去乙酰化（Histone Deacetylation）等。DNA甲基化转移酶抑制剂（DNAmethyltransferases inhibitors,DNMTi）以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histonedeacetylase,inhibitors,HDACi）被证明在多种肿瘤中具有治疗作用,可以使肿瘤中的抑癌基因重新表达,诱导细胞分化、抑制生长,诱导凋亡等,但其具体的分子作用机制仍不清楚。本课题旨在探讨DNA甲基化转移酶抑制剂5-AZA-dC（5-aza-deoxycytidine）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素（trichostatin A,TSA）联合应用对胰腺癌的治疗作用。通过体外试验探讨对胰腺癌细胞增殖、凋亡和细胞周期及其相关基因的影响,同时检测增殖和凋亡相关基因表达的变化,体内试验观察对胰腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。初步探讨其在治疗胰腺癌的作用及其作用机制。一、HDAC1蛋白和DNMT1蛋白在人胰腺癌组织中的表达目的检测HDAC1蛋白和DNMT1蛋白在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达情况,并对其在组织中表达的一致性进行相关性分析。材料和方法胰腺癌组织及相应癌旁组织标本23对。采用生物素-过氧化酶（streptavidin peroxidase,SP）免疫组织化学法检测胰腺癌和癌旁组织HDAC1蛋白和DNMT1蛋白表达,分析肿瘤组织与癌旁组织的阳性率差别;同一组织来源相邻切片进行配对,对HDAC1蛋白及DNMT1蛋白阳性率进行相关性分析。结果HDAC1蛋白及DNMT1蛋白均在胰腺导管细胞癌组织细胞核表达,染色为棕黄色,癌旁组织中多为阴性。胰腺癌与癌旁组织HDAC1蛋白表达阳性率分别为56.21%±10.26%和6.24%±5.28%,DNMT1蛋白表达阳性率分别为54.83%±23.33%和6.30%±10.78%,胰腺癌与癌旁组织阳性率均有极显著性差异（P=0.00）。相关性检验显示HDAC1蛋白与DNMT1蛋白表达相关系数0.713,有极显著统计学差异（P=0.00）。结论HDAC1蛋白及DNMT1蛋白在胰腺癌组织中的表达呈特异性,且其表达显著相关,提示HDAC1及DNMT1可能共同参与了胰腺癌的发生和发展。二、TSA、5-AZA-dC对人胰腺癌细胞株增殖、凋亡和细胞周期的影响目的研究TSA、5-AZA-dC对体外培养的人胰腺癌细胞株增殖、凋亡和细胞周期的影响,观察DNA甲基化转移酶抑制剂与组蛋白去乙酰化抑制剂是否具有协同抑制肿瘤的作用。方法分别以0.1、0.5、2.0μmol/L浓度TSA干预胰腺癌PaTu8988细胞株24小时,0.5、2.0、10.0μmol/L浓度5-AZA-dC干预胰腺癌PaTu8988细胞株72小时后,以及2种药物联合治疗,按照给药浓度不同分为联合低、中、高浓度组4组,分别给予5-AZA-dC 0.5、2.0及10μmol/L,干预48小时,最后24小时给予TSA 0.5μmol/L。采用WST-8法检测细胞增殖变化,流式细胞术检测细胞周期及凋亡的改变。结果1.细胞增殖试验:TSA0.1、0.5、2.0μmol/组细胞存活率分别为95.11%±4.36%、77.84%±13.58%、69.78%±7.04%,与对照组相比差异有显著统计学意义（P＜0.05）。5-AZA-dC 0.5、2.0和10.0μmol/L组细胞存活率分别为94.91%±1.51%、88.19%±3.28%、81.93%±4.89%,其中2.0和10.0μmol/L组与对照组相比差异有显著统计学意义（P＜0.01）,三组间相比有显著统计学意义（P＜0.05）。联合治疗低、中和高浓度组细胞存活率分别为86.69%±9.07%、72.86%±4.19%及57.20%±9.67%,与对照组比较,低浓度组有显著统计学差异（P＜0.05）而另二组均有极显著统计学差异（P＜0.01）,提示联合治疗较单独用药可以达到更好的治疗效果2.流式细胞术检测细胞周期:TSA组G2/M期细胞百分率、凋亡细胞百分率均显著高于对照组（均P＜0.01）,表现为G2/M期阻滞及细胞凋亡率增加。5-AZA-dC组G2/M及S期细胞百分率均高于对照组（P＜0.05）,亦表现为G2/M期阻滞。结论TSA及5-AZA-dC均能有效地抑制胰腺癌PaTu8988细胞株的增殖,TSA及5-AZA-dC均通过阻断细胞周期停滞于G2/M期,诱导细胞凋亡。三、TSA、5-AZA-dC对增殖、凋亡及细胞周期相关基因表达的影响目的TSA、5-AZA-dC干预胰腺癌细胞株出现细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡,但其发生的分子机制尚不清楚,通过Real-time RT-PCR检测药物干预前后细胞周期及凋亡相关基因及蛋白表达的改变,并检测DNMT酶总体活性的变化,探讨抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡的作用机制。材料和方法TSA及5-AZA-dC干预胰腺癌细胞株,抽提细胞株总RNA,Real-time RT-PCR检测细胞周期相关基因p21和Cyclin D1、凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达变化,Western Blot检测蛋白表达,抽提核蛋白检测DNMT酶总体活性。结果1.细胞周期相关基因改变:与对照组比较,TSA组p21表达明显升高,Cyclin D1表达则明显降低,有显著性统计学差异（P＜0.05）;5-AZA-dC组p21表达升高,其中2.0μmaol/L及10.0μmol/L浓度有显著性统计学差异（P＜0.05）,Cyclin D1表达则略降低,但无显著性统计学差异。Western Blot检测相应的蛋白表达与其基因改变呈一致性。2.凋亡相关基因改变:与对照组比较,TSA组Bax表达无显著变化,Bcl-2表达则呈下降趋势,2.0μmol/L浓度与对照组比较显示有显著性统计学差异（P＜0.05）;5-AZA-dC组Bax表达呈升高趋势,但仅有10.0μmol/L有统计学差异（P＜0.05）,而Bcl-2表达虽有降低,但无显著性统计学差异。Western Blot检测相应的蛋白表达与其基因改变呈一致性。结论TSA及5-AZA-dC通过上调p21和/或下调Cyclin D1基因表达,导致其相关蛋白发生表达量改变,调控胰腺癌PaTu8988细胞周期,抑制细胞增殖和分化,诱导细胞凋亡,从而抑制了胰腺癌PaTu8988细胞株的生长。四、TSA、5-AZA-dC对胰腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用目的评价TSA、5-AZA-dC对胰腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响,探讨TSA、5-AZA-dC的抗肿瘤治疗价值。方法将人胰腺癌细胞PaTu8988接种至裸鼠背部皮下,随机分为对照组、TSA组、5-AZA-dC组和联合组4组,单次给药剂量分别为PBS 0.2ml、TSA1mg/kg、5-AZA-dC 3mg/kg和TSA 1mg/kg+5-AZA-dC 3mg/kg,以腹腔注射途径给药,隔日1次,共5次,观察裸鼠生命体征变化以及肿瘤大小的动态变化。实验结束后处死裸鼠切除肿瘤标本和脏器组织,进行免疫组化和HE染色,Real-time RT-PCR检测裸鼠移植瘤组织增殖及凋亡相关基因的表达。结果1.移植瘤生长曲线显示与对照组比较,TSA与5-AZA-dC均可使肿瘤生长速度减慢,肿瘤体积在各个时间点均小于对照组,联合治疗组对肿瘤的抑制作用最为明显,其次为TSA,各组与对照组相比差异具有显著性（P＜0.05）,联合治疗组与对照组相比具有极显著统计学差异（P＜0.01）。2.细胞周期及凋亡相关基因mRNA改变:与对照组比较,TSA组p21明显升高（P＜0.01）,Cyclin D1明显降低（P＜0.05）,Bax无显著变化,Bcl-2呈下降趋势;5-AZA-dC组p21升高（P＜0.05）,Cyclin D1略降低,Bax呈升高趋势,Bcl-2无显著变化。结论1.体内试验显示TSA、5-AZA-dC对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长具有抑制作用,联合用药对肿瘤的抑制作用优于单独用药。2.TSA与5-AZA-dC通过增强p21基因和抑制Cyclin D1基因导致肿瘤生长抑制。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 第一部分 人胰腺癌组织HDAC1及DNMT1蛋白表达的检测
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 TSA、5-AZA-CdR对胰腺癌细胞增殖及凋亡的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 TSA、5-AZA-dC对肿瘤基因及DNMT活性的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 TSA、5-AZA-CdR治疗裸鼠胰腺癌移植瘤实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 综述
• 参考文献
• 在读期间发表文章及参编专著
• 致谢