妊娠期肝内胆汁淤积症胎儿心肌细胞损伤机制研究

论文摘要

妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP,intrahepatic cholestasis of pregnancy）,是妊娠中晚期特有的并发症,临床上以孕妇发生皮肤瘙痒、黄疸异常为特征。大多伴有肝功能生化指标的异常。ICP孕妇预后良好,产后瘙痒和黄疸迅速消退。主要危害胎儿,致早产、胎儿宫内窘迫、神经系统损伤及死胎等,使围产儿发病率及死亡率升高。特别是妊娠晚期突然出现的胎死宫内（猝死）,难以预料,临床上也缺乏有效的检测手段。研究表明,约50%以上的胎儿猝死与此有关。因此很有必要探讨妊娠期肝内胆汁淤积症胎儿猝死的机制及影响因素,并提出相应的治疗方案。本研究通过检测ICP新生儿总胆汁酸、甘胆酸、心肌酶CK、LDH、肌钙蛋白及心电图,进行临床分析,并构建ICP孕鼠模型,研究ICP患者血清中高浓度胆汁酸与胎儿进行性加重的心律失常和突发性胎儿死亡的关系,从而进一步探讨ICP胎儿心肌损伤机制。本实验分两部分:第一部分:ICP新生儿脐血总胆汁酸水平与心肌酶谱,肌钙蛋白,心电图改变的关系。选择2009年1月至2011年1月于我院产前检查并住院分娩确诊为ICP（轻度、重度）孕妇及正常孕妇各50例,对其总胆汁酸、甘胆酸,AST、ALT、TBLL、DBLL、及其分娩新生儿的总胆汁酸、心肌酶谱中的肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）及肌钙蛋白,心电图进行测定。结果:1.正常对照组孕妇血清CG含量为2.7±1.5 mg/ml,重度ICP组血清CG含量为32.7±4.4 mg/ml,重度组CG值明显高于正常妊娠组、轻度组数倍到数十倍（P<0.01）;重度组TBA、ALT均比对照组、轻度组有所升高（P<0.05）,各为2～3倍或4～6倍;重度组TBIL、DBIL比正常对照组、轻度组轻度增高（P<0.05）。对照组与轻度ICP组无明显差异。CG诊断ICP的较为敏感指标之一。2. ICP新生儿脐血TBA水平明显高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。3. ICP轻度组、重度组与对照组新生儿LDH、CK、cTnI浓度比较。胆汁酸值越高,血清心肌酶活性也相应升高。轻度ICP组新生儿与对照组CK、LDH、cTnI水平相比无显著差异（P>0.05）,ICP重度组新生儿CK、LDH、cTnI水平明显高于对照组及轻度组,有显著差异（P<0.05）。4. ICP患儿TBA浓度与CK,cTnI、心电图有相关性。ICP患儿各有不同的临床表现,并伴有心肌酶谱各项指标不同程度的增高及不同类型的心电图改变;随着胆汁酸值的升高,血清心肌酶活性也有一定的升高,心电图异常率也相应增多,表明ICP患儿存在不同程度的心肌损伤。结论:高浓度胆汁酸对胎儿的心肌细胞有直接的毒性作用,是造成ICP胎儿猝死的原因之一。第二部分:大鼠ICP模型的构建及心肌细胞损伤机制探讨。实验选用清洁级SD雌性大鼠与雄性SD大鼠为模型,各选一对在一笼内共同饲养,每天通过观察是否有脱落的阴栓蜡块来确定是否妊娠,自发现阴栓脱落日起,分笼饲养待用。取孕14天,SD大鼠60只,随机分为高、低雌激素组和对照组,每组20只先抽血做各项生化指标的测定。随后分别在其后肢内侧皮下注射苯甲酸雌二醇,剂量分别为5.0 mg（/Kg.d）（高剂量）,1.2mg/（Kg.d）（低剂量）和2 ml/（Kg.d）的生理盐水,1次/天,连续5天。孕20天,以氯安酮120g/kg麻醉孕鼠剖宫取胎,收集一窝胎鼠,并将胎鼠逐个称重,、观察胎鼠、计算死胎率。每组孕鼠于孕14天建模前及20天（120mg/Kg氯胺酮麻醉后）剖宫产前从眶静脉采取全血2ml室温下静置3分钟,离心10分钟后取血清1ml检测各项生化指标。同时剖开子宫,收集一窝胎鼠,并逐个称重。胎鼠断头取血,一窝胎鼠的胎血集合在一起。同时取固定于10%甲醛的心肌组织,梯度乙醇脱水、浸蜡（8h）,石蜡包埋,连续切片（片厚5 m）,每间隔5张取1张切片,苏木精和伊红（Hematoxylin-Eosin Stain,HE）染色,观测胎鼠心肌组织切片及显微镜下病理结构改变,取胎鼠心肌组织进行HE染色观察病理结构改变及提取线粒体测定ROS及膜电势水平。结果:1.动物模型制备结果,用药都达到ICP的诊断标准,模型制备成功。2.高激素组晚期死亡胚明显高于低激素组及对照组。3.高激素组可引起孕鼠血清生化指标和心肌酶谱高于对照组。4.诱导ICP可以引起胎鼠胆酸升高、心肌酶谱变化,提示这可能是ICP导致突发不明原因死胎的原因之一。5.高激素组胎鼠较低激素组及对照组胎鼠心肌细胞明显萎缩,线粒体活性氧簇水平显著升高,而膜电势水平明显降低。结论:ICP大鼠动物模型制备结果,用药组达到ICP的诊断标准,模型制备成功。高浓度胆汁酸可能通过诱导心肌组织线粒体发生氧化应激、从而发挥其促进心肌细胞缺血缺氧性损伤、凋亡的毒性作用,并推测这可能是造成胎儿宫内猝死的原因。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 一、ICP 的研究进展
• 二、ICP 胎儿猝死发病机制的研究进展
• 三、妊娠期肝内胆汁淤积症动物模型的建立
• 实验一 ICP 新生儿脐血总胆汁酸水平与心肌酶谱，肌钙蛋白，心电图改变的关系
• 1 材料
• 1.1 对象
• 1.2 实验仪器
• 2 方法
• 2.1 样品采集
• 2.2 样品采集方法
• 2.3 判定标准
• 2.4 临床分析
• 2.5 统计学处理
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 胎鼠心肌细胞病理结构改变及线粒体氧化应激机制
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要材料和试剂
• 1.3 实验动物
• 2 方法
• 2.1 动物模型制备
• 2.2 标本的采集及处理
• 2.3 溶液的配置
• 2.4 心肌的提取
• 2.5 线粒体的鉴定
• 2.6 胎鼠心肌组织线粒体活性氧簇的检测
• 2.7 统计学处理
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢