论文摘要
研究背景:卵巢癌是严重威胁妇女健康的常见妇科肿瘤,死亡率居妇科肿瘤首位。由于其起病隐匿,早期筛查困难,大约2/3的患者在初诊时就已发生盆腹腔内的广泛种植。近年来,虽然随着肿瘤细胞减灭术的不断改善,以及以铂类为基础联合化疗的广泛应用,使80%的初治患者获得临床缓解。但是,随之发生的早期复发、化疗耐药令多年来卵巢癌的疗效并无显著改善。缺少有效的肿瘤标记物及早期筛查手段、早期转移、化疗耐药已成为目前卵巢癌治疗难以获得突破的主要瓶颈。因此,寻找有效的逆转耐药、抑制转移的治疗靶点,阐明其作用机制,在卵巢癌的治疗中显得愈发重要而迫切。Clusterin蛋白（丛生蛋白）是一种在多种组织中普遍存在的的异源二聚体硫酸化糖蛋白,广泛参与免疫调节、细胞黏附、细胞与细胞/基质间相互作用、细胞分化及转化调控、细胞周期调节、DNA修复、脂质转运等多项重要的机体活动。受到pre-mRNA选择性剪接机制的调控,在人体细胞中Clusterin基因经过转录、翻译最终形成两种成熟的蛋白亚型:与热休克蛋白相似,具有分子伴侣、细胞保护作用的sCLU和促进细胞凋亡的nCLU。研究发现,Clusterin蛋白与前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤发生密切相关。并指出:这些肿瘤组织中Clusterin表达增加可能是肿瘤自我保护机制中sCLU蛋白的一种应激反应,sCLU由此可能参与肿瘤发生、演进、获得性耐药等多种重要机制的调控。2005年1月《Cancer》杂志中D Xie等报道Clusterin蛋白在卵巢肿瘤中表达增加,并且其表达强度与卵巢癌恶性化程度、肿瘤转移、细胞凋亡间均存在相关性,但关于Clusterin是否参与卵巢癌恶性生物学行为的调控?如何实现?这一系列研究均尚未见报道。因此,结合Clusterin在其它恶性肿瘤中的研究,Clusterin基因在新的抗肿瘤治疗中将成为一个颇具魅力的靶点;关于Clusterin在卵巢癌中功能及作用机制的研究,将为探讨卵巢肿瘤发生、发展、转移、耐药机制提供一种新的思路与方法。研究目的:1)从细胞水平探讨不同Clusterin选择性剪接亚型在卵巢癌细胞的表达定位,以及各自与卵巢癌细胞表型、增殖的相关性;2)探讨Clusterin不同亚型对卵巢癌增殖、转移、耐药、凋亡的调控及可能作用途径;3)探讨RNAi阻断策略抑制sCLU蛋白表达对卵巢癌治疗的可行性。研究方法:1) PCR技术从pcDNA3.1（+）/CLU质粒中分别扩增CLU不同亚型mRNA,分别命名为CLUF、CLUT、CLUN;质粒重组技术分别构建pIRES2-EGFP/ CLUF、pIRES2-EGFP/CLUT、pIRES2-EGFP/CLUN真核正义表达载体;2)利用RT-PCR、免疫组织化学法检测Clusterin在各卵巢癌细胞系的差异表达;3)脂质体法将各Clusterin亚型正义表达载体转染卵巢癌SKOV3细胞株,荧光显微镜下观察EGFP表达、Western blot分别检测转染效率、转染细胞内各Clusterin亚型的表达及定位情况;4)免疫荧光法再次验证瞬时转染后各组细胞不同亚型Clusterin蛋白的表达、细胞内分布,结合倒置显微镜观察细胞表型的改变;5)流式细胞仪对比分析SKOV3-CLUN、SKOV3-Vec、SKOV3细胞周期变化,透视电镜观察细胞超微结构变化;6)经过G418抗性筛选,获得稳定转染SKOV3-CLUF,SKOV3-CLUT, SKOV3-Vec细胞株,MTT比色法绘制细胞生长曲线,观察Clusterin不同亚型sCLU、pnCLU蛋白对细胞增殖能力的影响;7)通过MTT实验进行体外药物敏感性分析,计算SKOV3-CLUF、SKOV3-CLUT、SKOV3-Vec及SKOV3细胞对顺铂的IC50值,分析sCLU、pnCLU蛋白过表达对细胞顺铂敏感性的影响;8) RT-PCR、Western blot检测顺铂作用下A2780细胞中Clusterin RNA及蛋白的诱导表达;9)依据shRNA设计原则,结合Clusterin基因序列特征及其受到pre-mRNA选择性剪接机制调控这一特点,设计、合成3对Clusterin shRNA寡核苷酸链单链引物CLU-shRNAⅠ、CLU-shRNAⅡ、CLU-shRNAⅢ;应用质粒重组技术,构建CLU基因shRNA真核表达质粒载体pSup/CLU-shRNAⅠ、pSup/CLU-shRNAⅡ、pSup/CLU-shRNAⅢ、及阴性对照pSup/Sc,并对其进行鉴定;10)脂质体法转染卵巢癌顺铂耐药细胞株CP70细胞,G418筛选,获得稳定转染CP70-shRNAI、CP70-shRNAⅡ、CP70-shRNAⅢ、CP70-Sc细胞株,RT-PCR、Western blot方法检测转染细胞Clusterin RNA、蛋白表达;11)平板克隆形成实验、MTT法绘制细胞生长曲线,观察抑制sCLU蛋白表达对CP70细胞形态、表型及增殖的影响;12)通过MTT实验进行体外药物敏感性分析,计算CP70-shRNAI细胞、及非特异阴性对照CP70-Sc细胞、空白对照CP70细胞对顺铂的IC50值,分析sCLU蛋白表达对细胞顺铂敏感性的影响;13)流式细胞术AnnexinⅤ/PI法比对RNAi抑制Clusterin基因前后CP70细胞在顺铂作用下凋亡率的改变,Western blot检测各组细胞内凋亡相关因子的表达及活化;14)细胞侵袭实验、划痕迁移实验比对RNAi抑制Clusterin基因前后CP70细胞转移能力的改变;研究结果:1) 5种卵巢癌细胞系中Clusterin RNA、蛋白表达检测结果表明:细胞内均存在Clusterin表达,但表达水平存在差异,其中CP70细胞呈强表达,SKOV3、HO8910细胞较弱,A2780、HO8910-PM细胞表达强度居二者之间;2)成功构建含有Clusterin不同亚型mRNA片段的pIRES2-EGFP/CLUF、pIRES2-EGFP/CLUT、pIRES2-EGFP/CLUN重组真核表达载体。并建立不同Clusterin亚型高表达的SKOV3-CLUF、SKOV3-CLUT、SKOV3-CLUN、及阴性对照SKOV3-Vec细胞株,Western blot检测表明:SKOV3-CLUF细胞Clusterin蛋白表达为位于胞浆内60kDa、40kDa的sCLU蛋白;SKOV3-CLUT细胞则表现为胞浆内相当于pnCLU蛋白的50kDa处表达显著;SKOV3-CLUN细胞不仅在胞浆的50 kDa处有蛋白表达,其胞核提取物在相当与于成熟型nCLU的55 kDa亦表达显著;3)倒置显微镜下观察、免疫荧光法检测、Hoechst染色结果显示:SKOV3-CLUF、SKOV3-CLUT细胞Clusterin蛋白以胞浆表达为主,细胞表型无显著变化;而SKOV3-CLUN细胞Clusterin蛋白主要位于胞核,并伴随其表达逐渐出现细胞皱缩、贴壁性减弱、核浓缩、核碎裂现象。流式细胞术细胞周期检测显示:SKOV3-CLUN细胞周期阻滞于G2-M期,G1期前出现亚二倍体凋亡峰。同时,透视电镜下观察显示:SKOV3-CLUN细胞呈典型凋亡细胞的形态学改变;4) G418筛选,获得SKOV3-CLUF、SKOV3-CLUT稳定转染细胞株,生长曲线检测显示:sCLU蛋白高表达促进了SKOV3-CLUF细胞生长,而位于胞浆的pnCLU高表达对SKOV3-CLUT细胞生长无显著影响;5) MTT体外药物敏感性实验显示:上调sCLU表达增强卵巢癌细胞顺铂耐药性;而上调pnCLU表达,则使细胞对顺铂敏感性增强（IC50值如下:SKOV3细胞,10.47μM;SKOV3-CLUF细胞,25.63μM;SKOV3-CLUT细胞,6.27μM）;6)小剂量顺铂作用下,A2780细胞中Clusterin RNA及sCLU蛋白均表现为时间依赖性的表达上调;7)成功构建Clusterin基因的shRNA真核表达质粒载体pSup/CLU-shRNAⅠ、pSup/CLU-shRNAⅡ、pSup/CLU-shRNAⅢ、并建立4组稳定转染细胞株:CP70-shRNAI、CP70-shRNAⅡ、CP70-shRNAⅢ、CP70-Sc细胞株;8)经RT-PCR,Western-blot检测证实:CP70-shRNAI、CP70-shRNAⅡ、CP70-shRNAⅢ细胞中Clusterin RNA、蛋白表达均呈现不同程度抑制;其中:重组质粒pSup/CLU-shRNAⅠ的干涉效果较好,其稳定转染细胞系CP70-shRNAI细胞中Clusterin RNA和蛋白表达抑制率分别为:91.7%和88.5%;9)平板克隆形成实验、MTT法绘制细胞生长曲线实验均表明:RNAi抑制sCLU表达在一定程度上抑制了CP70细胞的增殖;10) MTT体外药物敏感性实验显示:RNAi阻断sCLU表达增强了卵巢癌细胞顺铂敏感性;在同一药物浓度下,CP70-shRNAI细胞存活率明显下降, 48、72 hrs顺铂IC50值分别为10.26μM、7.06μM;而CP70细胞分别为55.57μM、37.24μM;11) RNAi抑制sCLU表达促进了顺铂作用下CP70-shRNAI细胞凋亡。AnnexinⅤ/PI法检测显示:10μM顺铂作用后24 hrs, 36 hrs,CP70细胞凋亡率为（2.3±0.2）%、（5.5±0.4）%,与之相比,CP70-shRNAI细胞凋亡率显著升高,分别为（17.3±1.1）%、（45.6±2.3）%（P<0.01）。Western Blot检测显示:10μM顺铂作用后24 hrs, CP70-shRNAI细胞出Bcl-2表达下调、Bax表达增加,以及Caspase-3, -9的活化和PARP的裂解,36 hrs后这种反应更加剧烈。与之对比,即使在顺铂作用后的36 hrs,CP70和CP70-Sc细胞均未见到凋亡相关因子表达及活性的改变;12)抑制sCLU表达,CP70-shRNAI细胞的侵袭、迁移能力均显著下降,24 hrs侵袭抑制率达61.2%（P<0.01）,24 hrs、48 hrs迁移抑制率分别达41.8%、45.0%（P<0.01）;结论:1)卵巢癌细胞中不同的Clusterin mRNA编码形成大小、分布、功能各不相同Clusterin蛋白亚型,其中:sCLU、pnCLU主要定位于胞浆,nCLU则集中于细胞核内。2) sCLU是一种细胞保护性蛋白,在调控卵巢肿瘤细胞稳态、增殖中发挥重要的作用,卵巢癌细胞中sCLU的高表达促使细胞耐药性增强。3) nCLU蛋白是一种促凋亡蛋白,SKOV3胞核内nCLU高表达,促使细胞周期G2-M期阻滞,诱发细胞凋亡。4)卵巢癌细胞中nCLU蛋白功能的发挥与其细胞核定位密切相关,nCLU蛋白的胞核定位取决于其编码序列中活性细胞核定位序列（NLS）的存在。5)结合sCLU在卵巢癌中的表达与细胞耐药密切相关,小剂量顺铂作用下其表达被诱导上调,以及sCLU蛋白的细胞保护性功能,我们推测卵巢癌细胞中sCLU的高表达在其获得性耐药中发挥重要的功能。6)胞浆内sCLU蛋白表达增强,是CP70细胞区别于A2780细胞的生物学特征之一,参与细胞耐药性的调节。7)针对Clusterin的shRNA能够有效的阻断卵巢癌细胞中Clusterin RNA、蛋白的表达,并以此抑制体内、体外细胞的生长增殖,降低细胞耐药性、下调细胞的侵袭、迁移能力。8) RNAi抑制Clusterin表达后卵巢癌细胞耐药性下调与其促进细胞在药物作用下Caspase9-Caspase3线粒体途径的细胞内源性凋亡通路的激活密切相关;反之,sCLU蛋白可能通过抑制应激细胞内源性凋亡通路的活化,发挥其抑制凋亡、保护细胞的功能,并以此诱发细胞耐药。9)位于线粒体膜的sCLU与Bax结合介导了sCLU对应激细胞凋亡的抑制。一方面:二者的结合阻止了Bax对线粒体膜的作用,抑制细胞色素C的释放,从而抑制细胞内源性凋亡的发生;另一方面:由于Bax的失活,同样使c-Myc途径的凋亡通路受到抑制;同时激活c-Myc介导的肿瘤细胞转化和演进。因此,肿瘤中sCLU表达增加不但能够抑制应激细胞的凋亡,诱发治疗抵抗,同时也促进了肿瘤细胞的恶化和演进。