草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白的功能及免疫原性分析

论文摘要

草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国淡水主要养殖品种，是“四大家鱼”之一。其饲养成本低，养殖范围广，但养殖过程病害较多，其中草鱼出血病可引起草鱼大批死亡，草鱼种苗阶段受感染的死亡率高达90%，给养殖生产带来了巨大的损失。引起草鱼病毒性出血病的病毒为草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus，GCRV），隶属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）、水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus，AQRV）。根据本实验室已获得的草鱼呼肠孤病毒广东株GCRV-GD108株全序列，本研究对其编码VP5蛋白的M5基因序列进行了分析，同时构建其原核表达载体，制备重组VP5蛋白，检测了其NTPase（核苷三磷酸酶，nucleoside triphosphatases）活性，并对其免疫原性进行了初步研究。1.草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株M5基因序列分析GCRV-GD108的M5基因全长2230bp，含一个开放阅读框（ORF）2178bp。Blast结果显示M5基因编码分子量大小约80ku的蛋白。氨基酸序列分析表明，该蛋白与水生呼肠孤病毒属中多个病毒株的核衣壳蛋白VP5的氨基酸同源性为24%-25%；与哺乳动物正呼肠孤病毒（Mammalian reovirus，MRV）的μ2及禽呼肠孤病毒（Avianreovirus，ARV）的MμA也有较高的同源性（20%）。且该蛋白包含一段μ2样NTP结合保守区域，因此可确定GCRV-GD108株M5基因编码的蛋白为VP5，与MRV的μ2和ARV的μA蛋白同源。2. GCRV-GD108株M5基因原核表达载体的构建及表达以根据已获得的M5基因cDNA序列，分别设计合成带特定酶切位点的特异引物，进行PCR扩增；通过酶切与连接，构建了两种重组表达载体pET30c-M5和pColdⅡ-M5，分别转化于大肠杆菌并进行诱导表达；对培养基、诱导时间、诱导剂浓度和温度等条件进行优化，确定最适表达体系。SDS-PAGE和Western Blot对表达产物进行鉴定。结果显示所构建的两种VP5蛋白原核表达载体，均在大肠杆菌中成功地表达了分子量大小与预期相符（约为80ku）的重组蛋白，且表达产物主要存在于包涵体中。诱导表达后的菌体经离心、洗涤与超声破碎，离心收集包涵体。包涵体通过变性、透析与复性，获得纯化的重组蛋白，其中pET30c-M5/BL21（DE3）工程菌的目的蛋白占全菌蛋白的22.5%，纯化后获得了高纯度的重组蛋白（>95%）。比较两种表达载体的表达结果，认为表达载体pET30c-M5具有诱导表达耗时少、获得重组蛋白量大的优势,可为下一步的研究提供足量的蛋白。3.重组GCRV-GD108株VP5蛋白NTPase活性及免疫原性分析重组蛋白经纯化后，进行ATPase活性测定，通过钼酸铵比色法分析显示重组VP5蛋白具有一定的ATPase活性，活力为0.693μmolPi/mgprot/hour。同时用重组蛋白免疫草鱼，采用荧光定量PCR方法分析诱导前后草鱼头肾组织IgM基因表达水平的变化，结果显示免疫组IgM mRNA的水平均高于对照组。Elisa分析VP5蛋白诱导产生的抗体效价，结果显示呈现阳性反应，说明重组蛋白能诱导产生特异性抗体。但对草鱼的保护性实验结果显示，免疫组几乎没有保护效果。本研究结果说明VP5应可在病毒内部RNA转录过程起作用，同时该蛋白具有免疫原性，但诱导产生的抗体未能为草鱼提供抗病毒保护。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 1 草鱼呼肠孤病毒
• 1.1 草鱼呼肠孤病毒的分类
• 1.2 草鱼呼肠孤病毒的理化性质
• 1.3 草鱼呼肠孤病毒的复制、转录和翻译机制及致病机理
• 1.4 草鱼呼肠孤病毒核酸序列及编码蛋白
• 1.5 GCRV-GD108 株
• 2 草鱼病毒性出血病疫苗研究进展
• 2.1 GCRV 疫苗研究进展
• 2.2 GCRV 基因工程亚单位疫苗研究进展
• 2.3 GCRV 防治研究的新趋势
• 3 GCRV VP5 蛋白及 MRV 与 ARV 同源物的研究进展
• 4 原核表达系统
• 4.1 不同表达系统的比较
• 4.2 原核表达系统中的常用系统
• 5 NTPase 活性测定实验原理
• 6 本研究的目的与意义
• 第一章 草鱼 GCRV-GD108 株 VP5 表达载体构建及蛋白纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 宿主菌、质粒和酶
• 1.2 主要试剂
• 1.2.1 主要试剂盒
• 1.2.2 常用缓冲液
• 1.2.3 培养基
• 1.2.4 蛋白 SDS-PAGE 用试剂
• 1.2.5 蛋白纯化试剂
• 1.2.6 Western blot 试剂
• 1.3 软件分析 M5 基因序列
• 1.4 M5 基因编码蛋白的抗原性分析
• 1.5 目的基因的扩增及其克隆
• 1.5.1 M5 基因 PCR 扩增
• 1.5.2 PCR 扩增的琼脂糖凝胶检测及目的片段的回收
• 1.5.3 大肠杆菌 DH5α感受态制备
• 1.5.4 M5 基因改造克隆及转化
• 1.5.5 菌液 PCR 检测克隆结果
• 1.6 重组质粒 pET30c-M5 和 pColdⅡ-M5 的构建
• 1.6.1 克隆质粒提取
• 1.6.2 载体质粒提取
• 1.6.3 质粒 pMD-19T-pET-M5 和 pET30c 的双酶切
• 1.6.4 质粒 pMD-19T-pCold-M5 和 pColdⅡ的分步单酶切
• 1.6.5 载体片段和目的基因片段的连接
• 1.7 重组质粒和表达菌株的获得
• 1.7.1 重组质粒的转化和鉴定
• 1.7.2 两种重组质粒的提取
• 1.7.3 表达菌株的获得
• 1.8 重组蛋白的诱导表达条件优化
• 1.8.1 基因工程菌的初步诱导表达
• 1.8.2 宿主菌、培养基及诱导时间的优化
• 1.8.3 诱导温度的优化
• 1.8.4 诱导剂浓度的优化
• 1.9 重组蛋白的大量表达、纯化及 Western Blot 分析
• 1.9.1 重组蛋白包涵体复性
• 1.9.2 镍亲和柱纯化重组 VP5 蛋白
• 1.9.3 重组蛋白的变性、透析复性纯化
• 1.9.4 纯化后重组蛋白的 Western blot
• 2 结果与分析
• 2.1 基因序列分析
• 2.2 抗原性分析
• 2.3 M5 基因克隆及原核表达载体的构建
• 2.4 重组蛋白的诱导表达及条件优化
• 2.5 重组蛋白的纯化
• 3 讨论
• 第二章 VP5 蛋白的 NTPase 活性及免疫原性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料，仪器
• 1.2 实验所需试剂
• 1.2.1 纯化 buffer
• 1.2.2 ATP 酶测定实验所需溶液
• 1.2.3 ELISA 所用试剂
• 1.3 蛋白纯化条件的确立
• 1.3.1 免疫试验用重组 VP5 蛋白的纯化
• 1.3.2 活性测定用重组 VP5 蛋白的纯化
• 1.3.3 包涵体变性复性纯化
• 1.4 重组 VP5 蛋白 ATPase 活性分析
• 1.4.1 ATPase 试剂盒初步鉴定重组蛋白活性
• 1.4.2 重组蛋白活性的影响因素
• 1.5 重组蛋白的免疫保护试验
• 1.6 Elisa 测定抗体效价
• 1.7 荧光定量 PCR 测定草鱼头肾 RNA 拷贝数
• 1.7.1 草鱼头肾总 RNA 的提取
• 1.7.2 草鱼头肾总 RNA 的反转录
• 1.7.3 荧光定量 PCR 测定草鱼 mRNA 水平
• 2 结果与分析
• 2.1 重组蛋白纯化体系的筛选
• 2.2 重组蛋白 ATPase 活性初步鉴定结果
• 2.3 NTPase 活性影响因素实验结果
• 2.4 免疫保护实验
• 2.5 Elisa 分析草鱼血清抗体
• 2.6 荧光定量 PCR 检测 IgM mRNA 水平
• 3 讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录 A 缩略词表
• 附录 B 质粒图谱
• 附录 C 在读期间发表文章
• 致谢