杂柑的遗传多样性与亲缘关系研究

论文摘要

本研究采用RAPD技术对来源于中国柑桔研究所和成都蒲江两地的19个优良杂柑栽培品种进行遗传分析,并选取9个来源于中国柑桔研究所的柑橘属及近缘属其他品种为对照,以期为杂柑种质资源收集、保存、鉴定、评价、分类以及亲缘关系研究提供参考方法和理论依据。同时研究川渝不同栽培地区优良杂柑‘不知火’的遗传背景及遗传差异,以期为川渝‘不知火’栽培品种真实性及防止‘不知火’遗传变异提供科学依据。结果如下:1.通过核酸沉淀外观观察、紫外分光光度分析、凝胶电泳检测和RAPD-PCR扩增反应对柑橘基因组DNA提取的五种方法比较,认为SDS法、核DNA法、CTAB法和适合微生物DNA提取的微波法均能有效提取柑橘基因组,而改良微波法不能有效提取柑橘基因组。从PCR扩增结果看,又以微波法提取的杂柑DNA质量较高,是完全可以进行RAPD扩增,并且较其他方法耗时短、效率高,因此,适合微生物DNA基因组的提取方法（微波法）更适合柑橘基因组的提取。2.采用常规的单因素试验设计法对杂柑RAPD-PCR反应的主要成份和参数进行多次优化,适合杂柑RAPD扩增的最佳反应体系为:20μL反应体系中含模板DNA25ng,10×buffer2μl,Mg2+2.0mmol/L,引物0.5μmol/L,dNTPs0.22mmol/L,TaqDNA聚合酶1.4U。反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2min,43个循环;72℃继续延伸10min,4℃保温。3.以果实性状差异较大的五份材料‘不知火’、‘星路比’、‘朋娜’、晚白柚和枳为试材,在100条RAPD随机引物中筛选出16条扩增效果较好的引物。16条引物共扩增出270条RAPD位点,平均每个引物16.25个位点,DNA片段大小为200—4500bp,其中有254条带具有遗传多态性,约占总数的94.07%;每个引物检测到的RAPD多态谱带不等,从7条到22条,平均15.875条。这表明杂柑种质个体间的DNA多态性是丰富的,因此,采用RAPD标记完全能从DNA水平上检测到这些种质柑橘材料间的差异。4.19个杂柑材料被成功区分为两类,其中10份杂柑（‘天草’、‘不知火’、‘清峰’、‘津之香’、‘阳香’‘默科特’、‘诺瓦’、‘日辉’、‘爱媛14号’）被聚为宽皮柑橘类,9份杂柑（‘有明’、‘明尼奥拉’、‘星路比’葡萄柚、‘火焰’葡萄柚、‘红肉’葡萄柚、‘黄果柑’、‘胜山伊予柑’、‘宫内伊予柑’、‘卡里佐’）和橙类柚类聚为另一类。都未被聚为枳类。5.在16个RAPD引物在28个杂柑及对照柑桔属及近缘属品种中检测到只存在与枳及枳的后代中的一条特异性条带,该条带由引物104（GTGACGTAGG）扩增出来,为1519bp。在后来的进一步试验中证实了这条特异性带仅存在枳及其杂种中,目前已对其进行成功测序,国内外未见报道,其功能还有待进一步研究。6.对川渝不同地区栽培的‘不知火’的RAPD-PCR扩增结果表明不同渠道引进的‘不知火’分为两大类,从中国柑橘研究所引种的聚为一类,从华中农业大学引种的则聚为另一类。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词
• 1 前言
• 2 文献综述
• 2.1 柑橘属植物的遗传多样性
• 2.1.1 柑橘属植物种间关系研究
• 2.1.2 杂柑的遗传多样性
• 2.2 DNA分子标记及其在柑橘类植物中的应用
• 2.2.1 DNA分子标记技术
• 2.2.2 DNA分子标记在柑橘柑橘类植物中的应用
• 3 研究的目的和意义
• 4 材料和方法
• 4.1 材料
• 4.2 主要仪器
• 4.3 主要试剂
• 4.3.1 试剂来源
• 4.3.2 主要试剂
• 4.4 方法
• 4.4.1 技术路线
• 4.4.2 基因组DNA的提取和检测
• 4.4.3 RAPD分析及其技术体系的建立
• 4.4.4 特异性片段的序列测定
• 5 结果与分析
• 5.1 不同提取方法提取的杂柑基因组DNA质量分析
• 5.1.1 核酸外观沉淀和紫外分光光度法分析
• 5.1.2 DNA琼脂糖凝胶电泳检测
• 5.1.3 总DNA的PCR检测
• 5.2 RAPD反应体系优化
• 2+浓度对柑桔RAPD-PCR扩增的影响'>5.2.1 Mg²⁺浓度对柑桔RAPD-PCR扩增的影响
• 5.2.2 引物浓度对柑桔RAPD-PCR扩增的影响
• 5.2.3 Taq酶浓度对柑桔RAPD-PCR扩增的影响
• 5.2.4 dNTPs浓度对柑桔RAPD-PCR扩增的影响
• 5.2.5 DNA浓度对柑桔RAPD-PCR扩增的影响
• 5.3 RAPD的引物筛选及产物的多态性分析
• 5.4 材料间相似系数和聚类结果
• 5.4.1 所有材料的遗传距离和聚类结果
• 5.4.2 不同地区杂柑‘不知火’间遗传差异分析
• 5.5 特异性条带克隆
• 6 讨论
• 6.1 DNA提取方法与DNA质量检测
• 6.2 RAPD扩增影响因素
• 6.3 RAPD对杂柑种质的鉴定
• 6.4 杂柑种质的遗传差异
• 6.5 不知火的遗传差异分析
• 6.6 特异性条带的回收及分析
• 7 结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间论文发表情况