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中介蝮（Gloydius intermedius）蛇毒磷脂酶A2神经毒素的分离纯化及生物学活性鉴定

2020-12-10阅读(580)

中介蝮（Gloydius intermedius）蛇毒磷脂酶A2神经毒素的分离纯化及生物学活性鉴定

论文摘要

中介蝮（Gloydius intermedius）为蝰科蝮亚科毒蛇,是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种蝮蛇,广泛分布于我国西北和华北地区。蛇毒磷脂酶A2（Snake venom phospholipase A2, svPLA2）是蛇毒液中毒性最强的组分之一,除酶活性外,还表现出多种毒理药理学活性,具有潜在的利用价值。但是,关于中介蝮蛇磷脂酶A2神经毒素的毒理学活性、结构与功能的关系、作用机理等有待阐明,而分离获得PLA2神经毒素是解决这些问题的前提。本论文的研究内容及结果：1.中介蝮蛇毒PLA2的分离纯化（1）凝胶过滤层析利用凝胶过滤填料Sephacryl-200HR对中介蝮粗毒进行初步分离,缓冲液为50mmol/L碳酸氢铵（pH8.0）,分离得到5个蛋白峰（P1-P5）。分别测定各个峰组分磷脂酶A2活性及小鼠急性毒性实验,SDS-PAGE分析各个峰组分的蛋白纯度。结果表明,P2与P3为磷脂酶A2神经毒素,而P1、P4、P5中均不是磷脂酶A2神经毒素。SDS-PAGE分析表明这两个目的蛋白峰不是单一条带,因此需要进一步分离。（2）阴离子交换层析利用HiTrap DEAE阴离子交换层析柱对P2和P3做进一步的分离纯化,先用A液（50mmol/L醋酸铵,pH7.3）洗脱未结合的组分,之后0%-100%B液（50mmol/L醋酸铵,0.5mol/LNaCl,pH7.3）进行线性梯度洗脱。收集各个穿透峰及洗脱峰,分别测定各个峰组分磷脂酶A2活性及小鼠急性毒性实验,SDS-PAGE分析各个组分的蛋白纯度。结果表明,P2-5、P3-2和P3-3为PLA2神经毒素,SDS-PAGE分析表明P2-5、P3-2和P3-3不是单一条带,仍需进一步的分离纯化。（3）阳离子交换层析利用HiTrapCM阳离子交换层析柱对P2-5、P3-2和P3-3进行分离纯化,A液（50mmol/L醋酸铵,pH5.3）洗脱未结合的组分,之后0%-100%B液（50mmol/L醋酸铵,0.5mol/LNaCl,pH5.3）进行线性梯度洗脱,收集各穿透峰及洗脱峰。分别测定各个峰组分的磷脂酶A2活性及小鼠急性毒性实验,用SDS-PAGE分析各个组分的蛋白纯度。结果表明,P2-5-1、P3-2-1、P3-3-1具有酶活性,是导致实验动物偏瘫、呼吸衰竭的致死组分,为磷脂酶A2神经毒素。SDS-PAGE分析显示,P2-5-1、P3-2-1、P3-3-1纯度很高,接近单一条带,分子量在14kDa左右。2.生物学活性初步检测：（1）酶活性：采用人工合成底物4-硝基-3-苯甲酸（NOB）测得P3-2-1的酶活力为352nmol/minmg, Vmax为7.21nmol/min,最适温度为35℃,最适pH为8.0,且依赖于Ca2+。（2）间接溶血活性：采用红细胞血红蛋白释放法测定P3-2-1组分的间接溶血活性,1%Triton X-100为阳性对照、等体积的Tris-HCl为阴性对照,结果表明P3-2-1组分具有一定的溶血活性,溶血率为21%。（3）肌肉毒性：采用CK肌酸激酶试剂盒测定中毒小鼠血清肌酸激酶（CK）的酶活力。小鼠肌肉注射P3-2-1组分后,2h、4h、6h、8h与Oh组相比,CK酶活力均显著升高,注射2h后酶活力达到最大值。（4）抑菌活性：粗毒为阳性对照,无菌去离子水为阴性对照,检测P3-2-1组分对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效应,结果显示P3-2-1可显著地抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长,说明P3-2-1具有抑菌活性。结论：采用凝胶过滤层析和离子交换层析技术,成功地从中介蝮蛇粗毒中分离纯化得到磷脂酶A2神经毒素,分子量为14kDa,最适温度为35℃,最适pH为8.0,依赖于Ca2+,具有间接溶血活性、肌肉毒性及抑菌活性。本工作为进一步研究中介蝮磷脂酶A2神经毒素的分子进化及作用机理奠定了理论基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  • 1.1 蛇毒
  • 2'>1.2 蛇毒磷脂酶A2
  • 2分类'>1.3 蛇毒磷脂酶A2分类
  • 2结构特征'>1.4 蛇毒磷脂酶A2结构特征
  • 2功能'>1.5 蛇毒磷脂酶A2功能
  • 1.5.1 酶活性
  • 1.5.2 毒理药理活性
  • 1.6 蛇毒神经毒素
  • 1.6.1 突触前神经毒素
  • 1.6.2 突触后神经毒素
  • 2突触前神经毒素作用机理'>1.7 蛇毒磷脂酶A2突触前神经毒素作用机理
  • 2受体分子'>1.7.1 磷脂酶A2受体分子
  • 1.7.2 胞内分子事件
  • 2分离方法研究进展'>1.8 蛇毒磷脂酶A2分离方法研究进展
  • 1.9 本文工作
  • 2神经毒素的分离纯化'>第2章 中介蝮蛇毒磷脂酶A2神经毒素的分离纯化
  • 2.1 引言
  • 2.2 实验材料及试剂
  • 2.3 实验仪器
  • 2.4 实验方法
  • 2.4.1 中介蝮粗毒的采集
  • 2.4.2 凝胶过滤层析
  • 2.4.3 DEAE sepharose Fast Flow阴离子交换层析
  • 2.4.4 CM sepharose Fast Flow阳离子交换层析
  • 2.4.5 蛋白含量的测定
  • 2.4.6 蛋白质分子质量的测定（SDS-PAGE）
  • 2活性'>2.4.7 NOB测定PLA2活性
  • 2.4.8 小鼠急性毒性试验
  • 2.4.9 透析袋的处理
  • 2.5 实验结果
  • 2.5.1 凝胶过滤层析
  • 2.5.2 阴离子交换层析
  • 2.5.3 阳离子交换层析
  • 2神经毒素生物学活性鉴定'>第3章 中介蝮蛇毒磷脂酶A2神经毒素生物学活性鉴定
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料与方法
  • 3.2.1 实验仪器
  • 3.2.2 实验试剂及实验材料
  • 2酶活性'>3.2.3 卵磷脂平板法测定PLA2酶活性
  • 3.2.4 P3-2-1组分与中介蝮粗毒PLA2活性的比较
  • 2酶活力的影响'>3.2.5 温度对PLA2酶活力的影响
  • 2酶活力的影响'>3.2.6 pH对PLA2酶活力的影响
  • 2酶活力的影响'>3.2.7 底物浓度对PLA2酶活力的影响
  • 2酶活力的影响'>3.2.8 二价金属离子对PLA2酶活力的影响
  • 3.2.9 间接溶血活性
  • 3.2.10 CK肌酸激酶测定
  • 3.2.11 抑菌活性
  • 3.3 实验结果
  • 2酶活性'>3.3.1 卵磷脂平板法测定PLA2酶活性
  • 2活性的比较'>3.3.2 P3-2-1组分与中介蝮粗毒PLA2活性的比较
  • 2酶活力的影响'>3.3.3 温度对PLA2酶活力的影响
  • 2酶活力的影响'>3.3.4 pH对PLA2酶活力的影响
  • 2酶活力的影响'>3.3.5 底物浓度对PLA2酶活力的影响
  • 2酶活力的影响'>3.3.6 二价金属离子对PLA2酶活力的影响
  • 3.3.7 间接溶血活性
  • 3.3.8 CK肌酸激酶测定
  • 3.3.9 抑菌活性
  • 第4章 讨论
  • 4.1 分离纯化
  • 4.2 活性检测
  • 4.3 小结
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 攻读硕士期间研究成果

    • 相关论文文献

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