PRRSV CH-1a株致弱过程中的遗传变异分析及CH-1R株全长cDNA分子克隆的构建

论文摘要

本研究选择了PRRSV CH-1a株致弱过程中的4个不同代次进行了全基因组序列的测定与分析,并进行了PRRSV CH-1R全长cDNA分子克隆的构建。PRRSV CH-1a致弱过程中的4个代次分别命名为P39,P71,P148和P171,并对这4个代次进行了全基因组序列的测定。应用相关的分子生物学软件对其序列及其编码产物进行了分析。序列测定结果表明,PRRSV CH-1a株致弱过程中4个不同代次的Nsp2蛋白和3’ UTR区域的变异相对较大,尤其是Nsp2蛋白的变异,该蛋白可能具有种属特异性功能,具有耐受碱基插入、缺失和变异的能力。同祖代毒CH-la株相比,4个代次的Nsp2蛋白存在多处核苷酸的改变,同时位于3’UTR poly（A）尾巴的上游的高度保守的八核苷酸序列较祖代毒也发生了改变,该基元序列对RdRp的识别及病毒复制的启动可能起着重要的作用,其生物学意义有待进一步验证。设计并合成了覆盖PRRSV CH-1R株基因组的七对引物,采用RT-PCR方法,分别扩增各基因片段。通过沉默突变引入一个分子标记（Nhe I识别位点）以便于将来区分自然毒株和基因工程毒株。利用限制性内切酶,分别消化各基因扩增片段和pBluescript II SK（+）载体,构建PRRSV CH-1R株基因组的全长cDNA分子克隆（pBl-CH-1R）。采用PCR、限制性内切酶酶切法和基因组测序法对pBl-CH-1R进行鉴定,结果表明已成功构建了PRRSV CH-1R株的全长cDNA分子克隆。它不仅含有PRRSV CH-1R株的全基因组序列,还含有SP6启动子序列和一个分子标记（NheI识别位点）。PRRSV CH-1a的致弱过程中不同代次的全基因组序列的测定和CH-1R株全长cDNA分子克隆的构建,将为深入研究PRRSV的功能基因组学及其致病和变异的分子机制提供材料,还为研制新一代基因缺失疫苗和标记疫苗提供潜在应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展
• 1.1.2 RNA 病毒的反向遗传学研究进展
• 1.2 研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 4 个不同代次的全基因组测序及分析试验的材料和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 PRRSV CH-1R 株全长CDNA 分子克隆构建试验的材料和方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 4 个不同代次的全基因组克隆及测序分析
• 3.1.1 4 个不同代次的全基因组分段RT-PCR 扩增结果
• 3.1.2 全基因组序列的拼接及分析
• 3.2 重组质粒PBL-CH-1R 的构建及鉴定结果
• 4 讨论
• 4.1 4 个不同代次的全基因组克隆及测序分析
• 4.1.1 5'端及3'端非编码区的变异
• 4.1.2 非结构蛋白编码区的变异
• 4.1.3 结构蛋白编码区的变异
• 4.1.4 PRRSV 全基因组中与毒力相关的氨基酸
• 4.2 CH-1R 株全长CDNA 分子克隆的构建
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文