节杆菌中的渗透压胁迫感受器调节细胞分裂以及细胞壁发育

论文摘要

节杆菌是一种广泛存在于土壤中的微生物。它可以降解污染物,并且生成生物能源例如烃。另外节杆菌是现在发现的抗逆较强的微生物中的一种。在应对渗透压胁迫以及干旱胁迫上该菌表现的更加出色。因此现今国际上对于这一类微生物的研究越来越热。然而节杆菌抗逆的分子机制仍然未知。本研究发现节杆菌受到高渗透压胁迫以后细菌的形态会由单个细菌存在形式逐渐聚集成团呈类似菌丝体状生长。节杆菌的otsA (海藻糖六磷酸合成酶)缺失突变体即使生长在正常条件下也主要以聚集成团存在。聚团主要是由于节杆菌在分裂的时候细胞壁未能分离开造成的。节杆菌的otsA缺失突变体与节杆菌生长在高渗透压条件下均表现出生长缓慢的现象,代时明显比野生型生长在LB中长得多。本研究发现otsA缺失突变体生长速度的不是由于空间位阻造成的,也不是由于体内缺乏海藻糖造成的。而是由于otsA缺失可以造成体内新生细胞壁在分裂处聚合失败,最终导致分裂的失败。而新生细胞壁在分裂处聚合是分裂的必要条件。因此otsA缺失可以使节杆菌生长缓慢。进一步研究发现OtsA可以在节杆菌体内和FtsZ相互作用,并且在体外可以促进FtsZ的聚合。FtsZ是一种存在于细菌中的微丝类似蛋白,在绝大多数细菌中它的聚合是分裂的必要条件。新生细胞壁在分裂处定位的形成依赖于FtsZ在体内的聚合。OtsA在节杆菌体内可以促进FtsZ聚合导致新生细胞壁环状结构的在体内的形成。在otsA缺失突变体中FtsZ聚合减少,因此分裂缓慢。然而高盐处理可以抑制野生型节杆菌体内新生细胞壁环的形成,从而导致生长缓慢。OtsA在天然状态下呈高聚体形式存在。高盐处理对节杆菌体内OtsA以及FtsZ总含量的变化没有影响；然而在野生型中可以抑制体内OtsA以及FtsZ高聚体的存在。FtsZ高聚体与OtsA高聚体在节杆菌受到盐胁迫前后变化趋势相同。OtsA可能是通过与FtsZ相互作用形成了高聚体状,从而促进FtsZ的聚合；盐胁迫可以促使野生型节杆菌体内OtsA解聚,从而FtsZ聚合减少。OtsA的催化活性以及聚合状态对于促进FtsZ在节杆菌体内的聚合是必不可少的。盐胁迫可以促使野生型节杆菌体内OtsA解聚,从而FtsZ聚合减慢。另外生长在含有不同盐浓度的LB培养基中的野生型节杆菌也表现出同样的现象。另外高盐处理以及促使OtsA解聚均可以促进野生型节杆菌体内存在于新生细胞壁环状结构与细胞两端之间的非均一绕丝的概率；非均一绕丝是导致节杆菌抱团的原因。野生型节杆菌生长在正常条件下细胞壁表面是由大小均一的团块交织形成,并且存在交织纹理；otsA缺失突变体的细胞壁表面的团块大小并不均一,并且无交织纹理存在；而组成型表达OtsA的节杆菌生长在LB中时细胞壁表面基本上看不到团块,同时也看不到交织的纹理。力学结构上来说大小均一并且有纹理的交织是最有韧性,最难以破坏的；这是野生型节杆菌具有相对更好的耐受力的原因。盐胁迫造成节杆菌体内新生细胞壁迁移改变与细胞壁表面形态改变相同。新生细胞壁非均一绕丝可以造成细胞壁厚度增厚,在节杆菌分裂后期分裂的细胞难以分离,从而导致节杆菌抱团生长。综上所述,本研究发现节杆菌受到盐胁迫以后可以促进OtsA高聚体解聚,从而导致FtsZ聚合量减少,以及新生细胞壁环状结构形成失败,最终表现出生长缓慢。另外盐胁迫可以导致新生细胞壁在节杆菌体内非均一定位的增加,从而导致细胞壁的排布以及细胞壁的厚度变化,最终表现出节杆菌抱团生长。这是国际上首次发现细菌的渗透压胁迫感受器,以及该感受器调控的抗逆分子机理,为解释生活在极端环境的微生物抗逆的分子机理提出了重要的理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 节杆菌概论
• 1.1.1 节杆菌的分布与生物学功能
• 1.1.2 节杆菌的分类学特征
• 1.2 细菌分裂概论
• 1.2.1 骨架蛋白对于细菌分裂以及形态发生的影响
• 1.2.1.1 细菌中微丝类似蛋白及其功能
• 1.2.1.2 细菌中微管类似蛋白及其功能
• 1.2.1.3 细菌中中间纤维类似蛋白及其功能
• 1.2.1.4 放线菌中骨架蛋白研究现状
• 1.2.2 FtsZ蛋白对于细菌分裂的影响
• 1.2.2.1 Methanococcus jannaschii的FtsZ晶体结构与功能
• 1.2.2.2 FtsZ的结构域分析
• 1.2.2.3 FtsZ在细菌基因组中存在的位置的变化
• 1.2.2.4 FtsZ聚合对于细菌分裂的重要性
• 1.2.3 调节FtsZ聚合的蛋白
• 1.2.3.1 大肠杆菌中调节FtsZ聚合的蛋白
• 1.2.3.2 枯草芽孢杆菌中调节FtsZ聚合的蛋白
• 1.2.3.3 柄杆菌中调节FtsZ聚合的蛋白
• 1.2.3.4 分支杆菌中调节FtsZ聚合的蛋白
• 1.2.4 新生细胞壁对于细菌形态发生的影响
• 1.2.4.1 新生细胞壁研究方法的发展
• 1.2.4.2 新生细胞壁模型的总结
• 1.2.4.3 新生细胞壁染色的方法与局限
• 1.2.5 细菌骨架蛋白对于新生细胞壁定位的影响
• 1.2.5.1 调节枯草芽孢杆菌新生细胞壁的骨架蛋白mbl
• 1.2.5.2 放线菌中actin类似蛋白的研究进展
• 1.2.6 新生细胞壁与已有细胞壁形成之间的关系
• 1.3 节杆菌现今研究的状况与挑战
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 节杆菌培养条件
• 2.1.2 节杆菌中使用的质粒
• 2.1.2.1 节杆菌中组成型表达质粒
• 2.1.2.2 节杆菌中整合使用的质粒
• 2.1.3 大肠杆菌中使用的质粒
• 2.1.4 大肠杆菌菌株
• 2.2 基因克隆与大肠杆菌转化
• 2.2.1 DNA提取与基因克隆
• 2.2.2 质粒构建
• 2.3 节杆菌质粒电击转化方法
• 2.3.1 节杆菌电击感受态的制备
• 2.3.2 节杆菌电击用的质粒制备
• 2.3.3 节杆菌电击转化
• 2.4 节杆菌基因敲除与敲入
• 2.4.1 带有选择标签的敲除/敲入方式
• 2.4.2 不带有选择标签的敲除/敲入方式
• 2.5 蛋白质表达与纯化
• 2.5.1 蛋白质表达
• 6标签蛋白质纯化'>2.5.2 His₆标签蛋白质纯化
• 2.5.3 Gst标签蛋白质纯化
• 2.6 多克隆抗体制备
• 2.7 多克隆抗体纯化
• 2.8 免疫共沉淀
• 2.8.1 利用sepharose-proteinA做的免疫共沉淀
• 2.8.2 利用M2做的免疫共沉淀
• 2.9 细菌双杂交
• 2.9.1 细菌双杂交质粒与菌株
• 2.9.2 细菌双杂交筛选
• 2.10 荧光染色
• 2.10.1 新生细胞壁荧光染色
• 2.10.2 已有细胞壁荧光染色
• 2.10.3 DNA荧光染色
• 2.10.4 细胞膜染色
• 2.11 荧光显微镜分析
• 2.12 超速离心共沉淀
• 2.13 OtsA酶活分析
• 2.14 海藻糖含量测定
• 2.14.1 海藻糖酶的原核表达纯化
• 2.14.2 海藻糖含量的测定
• 2.15 突变质粒构建
• 2.16 原子力显微镜
• 2.16.1 细胞壁的制备
• 2.16.2 原子力显微镜分析
• 2.17 SDS-PAGE,Native-PAGE与Western blotting
• 2.17.1 样品制备
• 2.17.2 SDS-PAGE电泳
• 2.17.3 Native-PAGE电泳
• 2.17.4 SDS-PAGE Western blotting
• 2.17.5 Native-PAGE Western blotting
• 第三章 实验结果与分析
• 3.1 otsA缺失突变菌株形态与生长速度的变化
• 3.2 野生型节杆菌受到盐胁迫下形态与生长速度的变化
• 3.3 空间位阻不是影响otsA缺失突变菌株生长缓慢的原因
• 3.4 otsA缺失突变菌株海藻糖回补分析
• 3.5 强制降低野生型节杆菌体内海藻糖含量以及OtsA酶活相关分子后生长曲线分析
• 3.6 野生型节杆菌新生细胞壁定位分析
• 3.7 otsA缺失突变菌株新生细胞壁定位分析
• 3.8 组成型表达OtsA菌株新生细胞壁定位分析
• 3.9 盐胁迫不同时间野生型节杆菌新生细胞壁定位分析
• 3.10 盐胁迫不同时间otsA缺失突变菌株新生细胞壁定位分析
• 3.11 盐胁迫不同时间组成型表达otsA菌株新生细胞壁定位分析
• 3.12 生长在不同盐浓度下野生型节杆菌新生细胞壁定位分析
• 3.13 OtsA与FtsZ相互作用
• 3.14 OtsA对FtsZ聚合的影响
• 3.15 FtsZ抑制剂处理可以导致新生细胞壁环状结构的减少
• 3.16 盐处理不同时间OtsA与FtsZ在节杆菌体内的含量与聚合状态
• 3.17 生长在不同盐浓度下OtsA与FtsZ在野生型节杆菌体内的含量与聚合状态
• 3.18 OtsA聚合状态改变影响节杆菌的形态
• 3.19 盐处理前后野生型节杆菌细胞壁形态的变化
• 3.20 盐处理前后otsA缺失突变菌株细胞壁形态的变化
• 3.21 盐处理前后组成型表达otsA菌株细胞壁形态的变化
• 3.22 生长在不同盐浓度下野生型节杆菌细胞壁形态的变化
• 3.23 节杆菌体内不同OtsA含量造成的细胞壁厚度的变化
• 3.24 不同OtsA含量的节杆菌对于高盐的耐受程度
• 第四章 讨论
• 4.1 节杆菌利用OtsA这个保守的蛋白作为渗透压感受蛋白调节细菌的分裂
• 4.1.1 OtsA/B蛋白广泛存在于多种生命体中
• 4.1.2 OtsA以及相关代谢分子与细菌分裂之间的关系
• 4.2 FtsZ这个保守的蛋白在细菌分裂中受到的调节
• 4.2.1 FtsZ蛋白广泛存在于多种生命体中对细菌分裂起着重要的作用
• 4.2.2 FtsZ聚合受到调节的方式
• 4.3 新生细胞壁的定位与细菌抗逆
• 4.3.1 新生细胞壁的迁移与定位
• 4.3.2 细胞壁的结构与抗逆
• 4.4 小结
• 参考文献
• 在学期间的研究成果
• 致谢