玉米大斑病菌钙调磷酸酶基因的功能研究

论文摘要

玉米大斑病是由玉米大斑凸脐蠕孢菌（Exserohilum turcicum）引起的重要病害之一,流行年份常给玉米生产造成严重经济损失。植物病原真菌的生长、发育和致病性受真菌的细胞外信号转导途径调控,目前发现的植物病原真菌信号转导途径主要有3类:Ca2+信号途径、cAMP信号途径和MAPK信号途径。Ca2+途径的主要组成部分包括:钙调素（calmodulin,CaM）、磷脂酶C（phospholipase C,PLC）、和钙调磷酸酶（calcineurin,CaN）等。钙调磷酸酶是钙调素下游的重要靶蛋白之一,属丝/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员（又称蛋白磷酸酶2B,PP2B）,是迄今发现的唯一受Ca2+/钙调素（CaM）调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶,由一个催化亚基（CnA）和一个调节亚基（CnB）组成。CnB在结构上与CaM相似,有4个Ca2+结合位点。当Ca2+存在时,CnB和CaM结合在CnA上不同的位点,启动CaN催化活性。钙调磷酸酶是受Ca2+信号调控的一种多功能信号酶,不仅介导Ca2+信号转导通路,而且可以通过去磷酸化作用对其他信号转导通路进行调节,使Ca2+信号途径与其他信号途径的调节机制偶联起来,协同调节细胞的功能;钙调磷酸酶在调控真菌阳离子平衡、菌丝形态建成、细胞壁完整性以及致病性等方面都起着重要的作用。本文利用pSilent-1质粒,分别构建了玉米大斑病菌CnA和CnB基因的RNAi载体,并转化玉米大斑病菌原生质体,通过潮霉素B抗性筛选及PCR、Southern杂交及半定量RT-PCR鉴定获得26株CnA基因RNAi转化子和42株CnB基因RNAi转化子。对突变体的培养性状观察发现,突变菌株A-2:菌落灰白色、致密,菌落薄,气生菌丝少,菌落边缘较整齐,背面青褐色;突变菌株B-1:菌落浅褐色、细腻,菌落薄,气生菌丝少,菌落边缘不整齐,背面黄褐色;对突变体的菌丝显微观察发现,突变体A-2:菌丝细长,略透明,突变体B-1:菌丝细长,透明;推测突变体菌丝中黑色素含量降低。对突变体生长速度进行测定发现,突变菌株A-2的生长速度与野生型基本一致,而B-1的生长速度较慢;对突变体的产孢量测定发现两个突变菌株都不产生分生孢子;毒素生物学活性测定和致病性检测发现,突变体B-1和A-2对玉米叶片的致病力都有所减弱。通过半定量PT-PCR方法分析发现A-2突变体中STK1和PKA基因的表达量下降;B-1突变体中STK2的表达量下降;两个突变体中钙调素基因（CAM）的表达无明显改变。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.2 供试培养基
• 2.3 主要试剂及药品配制
• 2.4 主要仪器
• 2.5 玉米大斑病菌钙调磷酸酶CnA 基因RNAi 载体的构建
• 2.5.1 基因组DNA 的提取
• 2.5.2 载体构建策略
• 2.5.3 CnA 基因插入片段的扩增
• 2.5.4 PCR 扩增产物的凝胶回收
• 2.5.5 PCR 扩增产物的克隆
• 2.5.6 转化感受态细胞及测序
• 2.5.7 碱裂解法小量提取质粒
• 2.5.8 基因片段（A-Z 和A-F）与pSilent-1 载体质粒的重组
• 2.6 CnB 基因沉默表达载体的构建
• 2.7 CaN 基因RNAi 重组载体转化玉米大斑病菌原生质体
• 2.7.1 转化子验证及分析
• 2.7.2 探针制备
• 2.7.3 酶切
• 2.7.4 电转移
• 2.7.5 Southern Blotting
• 2.7.6 免疫检测
• 2.8 半定量RT-PCR 分析
• 2.8.1 总RNA 的提取
• 2.8.2 RNA 质量的检测
• 2.8.3 总 RNA 的纯化
• 2.8.4 第一链cDNA 的合成
• 2.8.5 RNAi 沉默转化子在不同基因的表达水平分析
• 2.8.6 半定量RT-PCR 的反应条件
• 2.9 玉米大斑病菌CnA 和CnB 基因RNAi 突变体分析
• 2.9.1 菌落特征
• 2.9.2 菌丝形态的显微观察
• 2.9.3 生长速度的测定
• 2.9.4 菌株产孢量的测定
• 2.9.5 突变菌株致病力测定
• 2.9.6 突变菌株HT-毒素活性
• 2.9.7 HT-粗毒素的生物测定
• 3 结果与分析
• 3.1 CnA 基因沉默载体的构建
• 3.1.1 CnA 基因片段的克隆
• 3.1.2 将同源片段与pMD19-T Simple Vector 及验证
• 3.2 CnB 基因沉默载体的构建
• 3.2.1 CnB 基因片段的克隆
• 3.2.2 将同源片段与pMD19-T Simple Vector 及验证
• 3.3 CnA 和CnB 基因沉默突变体的获得
• 3.3.1 原生质体转化和转化子筛选
• 3.3.2 沉默突变体的获得与PCR 验证
• 3.3.3 以hph 基因片段为探针对转化子进行 Southern blot 验证
• 3.4 突变体和野生型菌株中CAM、STK1、STK2、PKA 基因的表达分析
• 3.4.1 大斑病菌野生型和突变体RNA 的提取
• 3.4.2 CAM、STK1、STK2、PKA 基因的表达分析
• 3.5 CaN 基因的沉默突变体性状初步分析
• 3.5.1 菌落特征
• 3.5.2 WT 与突变体菌丝形态的显微观察
• 3.5.3 突变菌株与野生型的生长速度的测定
• 3.5.4 菌株的产孢量
• 3.5.5 突变菌株粗毒素生物学活性的测定
• 3.5.6 突变菌株的致病力检测
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢