论文摘要
在当今世界大力倡导可持续发展的大环境下,可持续发展思想及环保意识提高了生物防治技术的重要性,受到了国际社会的极大关注。构建出高效、广谱及价格低廉的生物农药来替代化学农药,最低限度的减少环境污染,达到绿色生产、绿色环保的目的。哈茨木霉（Trichoderma harzianum）是一种优良的生物防治真菌,在植物病害,尤其是土壤传染病害的生物防治中具有重要的应用价值。哈茨木霉主要通过重寄生作用、溶菌作用、抗生素作用、蛋白酶作用以及对空间和营养的竞争机制达到防治植物病原菌的目的。在各种恶劣的生存条件下哈茨木霉的抑菌功能受到了极大限制和破坏,限制了其生防潜力的进一步发挥。因而,提高哈茨木霉的防治效果,及保证其在逆境条件下生防功能顺利实现具有重要的意义。为增强哈茨木霉防治效果和对外界抵抗能力,利用真菌表达载体pBI121,pCAMBIA1301和克隆载体pUC18,成功构建了用于根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化表达载体pCA-GChiⅤ和pCA-GSOD。以潮霉素抗性基因为选择标记,目的基因的启动子为CaMV35S,两种载体分别含有几丁质酶（ChiⅤ）基因、超氧化物岐化酶（SOD）基因。对影响哈茨木霉转化的因素进行优化,获得了该系统转化哈茨木霉的最佳条件。经过潮霉素抗性选择培养,Southern杂交,RT-PCR及传代分析得到稳定遗传的转化子。采用与三种植物病原菌室内拮抗实验,检测重组ChiⅤ和SOD后的哈茨木霉转化子的抑菌活性。结果表明通过根癌农杆菌介导的转化系统所获得转ChiⅤ哈茨木霉转化子具有良好的抑菌活性,对植物病原菌都表现出很强的拮抗作用。通过根癌农杆菌介导的转化系统所获得SOD哈茨木霉转化子保持了哈茨木霉菌的抑菌活性,对哈茨木霉原菌和SOD哈茨木霉转化子进行高温和盐胁迫实验进行了比较,结果证实,哈茨木霉原菌在逆境下不能正常存活;而SOD木霉转化子转化后的哈茨木霉菌,在逆境下仍能正常存活,且对植物病原菌仍具备良好的拮抗作用。ChiⅤ基因在哈茨木霉中的表达,明显提高了哈茨木霉的抑菌能力。SOD基因在哈茨木霉中的表达,提高了哈茨木霉对高温和高盐的抗逆性,保证了哈茨木霉能够在高温和高盐的条件下发挥其生防功能。从而,为哈茨木霉的抑菌功能在更广泛的领域中应用奠定了基础。在获得的哈茨木霉（T. harzianum）EST序列基础上,为提高哈茨木霉菌抗外界干扰能力,克隆了与抗碱性盐和干旱相关的sod和hsp24基因的DNA序列,克隆获得的这些序列已在GenBank上注册。将克隆得到的sod和hsp24基因构建原核表达载体pET-sod、pET-hsp24,通过双酶切、测序检测证明重组载体构建成功。通过IPTG诱导使sod、hsp24基因在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中表达,SDS-PAGE检测分别获得15.7kD、24.0kD的蛋白带,蛋白大小与预期相符,说明它们已经在大肠杆菌（E. coli）中表达,并检测了sod蛋白粗酶活和hsp24的耐热功能,证明了哈茨木霉（T. harzianum）基因能够在原核生物中良好表达。为提高哈茨木霉菌（T. harzianum）的sod和hsp24基因表达效率,我们将sod和hsp24基因构建到带有高效启动子的酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）表达载体pYES2上,并转入酿酒酵母（S. cerevisiae）INVSc1细胞,得到了携带sod、hsp24外源基因的酵母转化子。逆境胁迫实验表明转sod、hsp24基因酵母对Na2CO3和干旱的耐受能力明显提高,表明sod、hsp24基因与哈茨木霉（T. harzianum）的抗逆境胁迫相关,这对研究哈茨木霉（T. harzianum）在自然界常见逆境下的生物防治能力具有重要意义。以上基因的克隆和功能研究为哈茨木霉（T. harzianum）其它功能基因的克隆和研究建立了完善的技术平台,对哈茨木霉（T. harzianum）重要生物防治基因的进一步发掘和利用具有重要意义。同时,将几丁质酶基因和超氧化物歧化酶基因分别转化到哈茨木霉（T. harzianum）中并表达,以及转化后的哈茨木霉菌的功能认定,使我们获得了良好生物防治效果的基因工程菌。为今后应用提供了科学依据。本项研究克隆了涉及生物防治和胁迫响应方面的基因,这些基因的获得将在揭示生物防治机理、研究哈茨木霉（T. harzianum）逆境下的生物防治能力变化以及其体内高价值酶基因的发掘等方面也具有重要意义,是系统地、多方位地对哈茨木霉（T. harzianum）的生物防治分子机理研究的开始。
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摘要Abstract第1章 绪论1.1 课题研究的目的与意义1.2 国内外在该方向的研究现状及分析1.2.1 表达序列标签（EST）1.2.2 木霉在植物病虫害生物防治中的应用1.2.3 几丁质酶研究进展1.2.4 超氧化物歧化酶研究进展1.2.5 热激蛋白研究进展1.2.6 丝状真菌转基因研究进展1.3 目前生物防治菌哈茨木霉应用中存在的问题1.4 课题来源及主要研究内容1.4.1 课题来源1.4.2 主要研究内容第2章 实验材料与方法2.1 哈茨木霉功能基因真菌表达2.1.1 真菌表达载体与菌株2.1.2 真菌表达载体构建主要试剂2.1.3 真菌表达载体构建实验方法2.1.4 真菌转化实验方法2.1.5 T88 及其转化子对峙实验方法2.1.6 T88 及其转化子的逆境胁迫实验2.2 哈茨木霉功能基因原核表达及酵母表达2.2.1 原核表达载体与菌株及主要试剂2.2.2 超氧化物歧化酶基因（sod）原核表达材料与方法2.2.3 小热激蛋白基因（hsp24）原核表达材料与方法2.2.4 酵母表达载体与菌株2.2.5 酵母表达主要试剂及培养基2.2.6 表达载体pYES2-sod、pYES2-hsp24 构建2.2.7 重组表达载体酵母转化2.2.8 酵母转化子的鉴定2.2.9 转sod、hsp24 基因酵母逆境胁迫实验方法第3章 哈茨木霉ChiⅤ基因在真菌中的表达研究3.1 表达载体 pCA-G ChiV 构建3.1.1 克隆载体pUC-GUS的构建3.1.2 中间载体pUC-GC的构建3.1.3 pUC18-G ChiⅤ的测序3.1.4 真菌表达载体pCA-G ChiⅤ的构建3.2 真菌转化实验3.2.1 转化前T88 对潮霉素的敏感性测定3.2.2 冻融法转化根癌农杆菌3.2.3 根癌农杆菌转化真菌影响因素分析3.2.4 转化pCA-G ChiⅤ及其初步鉴定3.2.5 转化子T-ChiⅤ的Southern blot分析3.2.6 转化子T- ChiⅤ的RT-PCR检测3.2.7 转化子T-ChiⅤ的传代分析结果3.3 对峙及胁迫实验3.3.1 T88 及转化子T- ChiⅤ对立枯丝核菌室内拮抗实验3.3.2 T88 及转化子T- ChiⅤ对尖孢镰刀菌的室内拮抗实验3.3.3 T88 及转化子T- ChiⅤ和核盘菌室内拮抗实验3.4 讨论3.4.1 真菌表达载体的选择3.4.2 真菌转化条件的优化3.4.3 几丁质酶的应用3.5 本章小结第4章 哈茨木霉Sod基因在真菌中的表达研究4.1 sod真菌表达载体构建4.1.1 克隆载体pUC-GUS的构建4.1.2 中间载体pUC-GS的构建4.1.3 pUC18-GSOD的测序4.1.4 真菌表达载体pCA-GSOD的构建4.2 真菌转化实验4.2.1 冻融法转化根癌农杆菌4.2.2 转化pCA-GSOD及其转初步鉴定4.2.3 转化子T-SOD的Southern blot分析4.2.4 转化子T-SOD的RT-PCR检测4.2.5 转化子T-SOD的传代分析4.3 对峙及胁迫实验4.3.1 T88 及转化子T-SOD对立枯丝核菌室内拮抗实验4.3.2 T88 及转化子T-SOD对尖孢镰刀菌的室内拮抗实验4.3.3 T88 及转化子T-SOD和核盘菌室内拮抗实验4.3.4 T88 及转化子T-SOD逆境胁迫及对峙实验4.4 讨论4.4.1 逆境条件下的T-SOD转化子4.4.2 全长cDNA基因获取方法的选择4.5 本章小结第5章 哈茨木霉菌功能基因原核及酵母表达研究5.1 超氧化物歧化酶基因的原核表达研究5.1.1 原核表达载体pET28-sod的构建5.1.2 原核表达质粒pET28-sod在大肠杆菌中的表达5.2 小热激蛋白基因的原核表达5.2.1 原核表达载体pET28-hsp24 的构建5.2.2 原核表达质粒pET28-hsp24 在大肠杆菌中的表达5.3 酿酒酵母生长曲线5.4 超氧化物歧化酶基因的酵母表达研究5.4.1 重组酵母表达载体pYES2-sod的构建5.4.2 sod基因酵母表达转录水平检测5.4.3 转基因酵母胁迫实验5.5 小热激蛋白基因的酵母表达5.5.1 重组酵母表达载体pYES2-hsp24 的构建5.5.2 hsp24 基因酵母表达转录水平检测5.5.3 转基因酵母胁迫实验5.6 原核表达及酵母表达的讨论5.6.1 原核表达过程中出现的问题及解决办法5.6.2 酵母转化子检测方法5.6.3 酵母总RNA提取方法改进5.6.4 酿酒酵母转化的影响因素分析5.6.5 转基因酵母逆境胁迫实验中碳源的选择原则5.7 本章小结结论参考文献攻读学位期间发表的学术论文致谢个人简历
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